一种利用四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体涉及一种利用四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法和应用。所述基因工程菌由重组载体pBAD

【技术实现步骤摘要】
一种利用四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种利用四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]羟基四氢嘧啶(1,4,5,6
‑
四氢
‑2‑
甲基
‑5‑
羟基
‑4‑
嘧啶羧酸)是四氢嘧啶的衍生物，是一种极性、易溶、生理pH范围内不带电荷的小分子有机物，是嗜盐微生物为抵抗高盐环境代谢产生的一种相容性溶质。研究发现，羟基四氢嘧啶同样具有四氢嘧啶渗透调节功能，在高温、干燥、高渗、冷冻等不良环境中保护和稳定核酸、细胞膜、蛋白质等物质的功能，并且因为其吸水保水能力更强，对核酸、细胞膜、蛋白等的保护作用要优于四氢嘧啶和其他相容性溶质。目前羟基四氢嘧啶已经广泛应用于在化妆品、医药、基因工程等领域。
[0003]在化妆品领域，基于羟基四氢嘧啶的渗透保护功能，可以作为保湿剂添加在化妆品中，既能防止皮肤干燥和衰老，又能减少紫外线对皮肤的伤害；在医药领域，羟基四氢嘧啶不仅可以加入药物中用于神经系统疾病的治疗，还可以作为化疗过程中健康细胞的保护剂；在基因工程
的应用，羟基四氢嘧啶可以提高双链DNA的解链温度，因此可以作为聚合酶链式反应的增强剂。
[0004]由于嗜盐微生物中具有羟基四氢嘧啶的合成途径，常规多利用嗜盐微生物发酵生产羟基四氢嘧啶。其不足在于培养过程中需要高浓度的NaCl来刺激菌体积累更多的产物，高浓度NaCl对发酵设备腐蚀严重，且发酵废液对环境造成较大压力；其发酵工艺需要多次更换发酵液，容易导致污染且耗费人力物力；且积累羟基四氢嘧啶同时会积累四氢嘧啶，后期难于分离；目前报道的羟基四氢嘧啶生产方法均产量低，达不到羟基四氢嘧啶的工业生产要求。

技术实现思路

[0005]针对现有嗜盐微生物发酵羟基四氢嘧啶时所需的高浓度NaCl对发酵设备腐蚀严重及羟基四氢嘧啶产量低的技术问题，本专利技术提供一种利用四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法和应用。
[0006]第一方面，本专利技术提供一种利用四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌的构建方法，所述基因工程菌由重组载体pBAD
‑
ectD导入出发菌株构建得到，所述出发菌株带有
△
araBAD阿拉伯糖代谢缺陷性状。
[0007]进一步的，所述重组载体pBAD
‑
ectD是基因ectD经同源重组连入载体pBAD
‑
HisA后得到的，基因ectD为四氢嘧啶羟化酶基因，构建由四氢嘧啶到羟基四氢嘧啶合成通路。
[0008]进一步的，载体pBAD
‑
HisA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0009]基因ectD的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0010]四氢嘧啶羟化酶ectD的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011]进一步的，所述出发菌株可选择大肠杆菌BW25113，基因型为(rrnB3
△
lacZ4787hsdR514
△
(araBAD)567
△
(rhaBAD)568rph
‑
1)。
[0012]第二方面，本专利技术提供一种采用上述构建方法得到的基因工程菌，所述基因工程菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)FRD
‑
ECT
‑
1，已于2022年1月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.24235。
[0013]第三方面，本专利技术提供一种上述构建方法得到的基因工程菌在利用四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶上的应用。
[0014]进一步的，所述基因工程菌利用四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶的方法包括如下步骤：
[0015](1)菌株活化：在超净工作台用接种环蘸取菌液，在固体斜面活化培养基中划线，放置于34
‑
37℃培养箱中培养12
‑
16小时；
[0016]所述固体斜面活化培养基成分为：酵母粉2.5
‑
10g/L，蛋白胨5
‑
15g/L，氯化钠5
‑
15g/L，琼脂粉15
‑
20g/L，其余为去离子水，调节pH值为7.2；
[0017](2)一级种子培养：在超净工作台用接种环刮取一环菌体，接种到装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，用八层纱布封口，在34
‑
37℃，200
‑
250r/min的条件下振荡培养过夜；
[0018]所述种子培养基成分为：酵母粉9
‑
15g/L，蛋白胨18
‑
30g/L，甘油3
‑
5g/L，磷酸二氢钾1.5
‑
5g/L，磷酸氢二钾10
‑
20g/L，其余为去离子水，调节pH值为7.2；
[0019](3)二级种子培养：按1％接种量转移一级种子到装有100mL种子培养基的1000mL三角瓶中，用八层纱布封口，在34
‑
37℃，200
‑
250r/min的条件下振荡培养5
‑
8小时，OD600生长至1.8
‑
2.0；
[0020](4)发酵：将二级种子液按8％
‑
15％接种量接种到新鲜的发酵培养基中，开始发酵，发酵过程中控制pH值在6.5
‑
7.5，温度控制在37
‑
24℃，将溶氧维持在20％
‑
40％；当培养基中的碳源消耗完，溶氧开始上升时，流补50％(m/V)的葡萄糖溶液，控制糖浓度在0.1
‑
5g/L，当OD值达到10
‑
15，降低培养温度至24
‑
32℃，加入L
‑
阿拉伯糖，继续发酵，发酵周期为12
‑
16小时；
[0021]所述发酵培养基成分为：酵母粉2.5
‑
10g/L，蛋白胨5
‑
15g/L，硫酸铵4
‑
10g/L，甘油0
‑
10g/L，蔗糖0
‑
10g/L，葡萄糖0
‑
10g/L，磷酸二氢钾1.5
‑
5g/L，磷酸氢二钾10
‑
20g/L，硫酸镁0.5
‑
2g/L，硫酸亚铁10
‑
200mg/L，硫酸锰10
‑
200mg/L，消泡剂0.1
‑
1g/L，其余为去离子水，调节pH值为7.2；
[0022](5)转化：发酵液4℃，3000
‑
4000rcf离心收本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述基因工程菌由重组载体pBAD
‑
ectD导入出发菌株构建得到，所述出发菌株带有
△
araBAD阿拉伯糖代谢缺陷性状。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述重组载体pBAD
‑
ectD是基因ectD经同源重组连入载体pBAD
‑
HisA后得到的。3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，载体pBAD
‑
HisA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；基因ectD的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述出发菌株的基因型为(rrnB3
△
lacZ4787hsdR514
△
(araBAD)567
△
(rhaBAD)568rph
‑
1)。5.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)FRD
‑
ECT
‑
1，已于2022年1月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.24235。6.一种如权利要求1
‑
4任一所述的构建方法得到的基因工程菌在利用四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶上的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述基因工程菌利用四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶的方法包括如下步骤：(1)菌株活化；(2)一级种子培养：在超净工作台用接种环刮取一环菌体，接种到装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，用八层纱布封口，在34
‑
37℃，200
‑
250r/min的条件下振荡培养过夜；(3)二级种子培养：按1％接种量转移一级种子到装有100mL种子培养基的1000mL三角瓶中，用八层纱布封口，在34
‑
37℃，200
‑
250r/min的条件下振荡培养5...

【专利技术属性】
技术研发人员：李海军，胡红涛，李珍爱，张英华，郑德强，贾开钰，王超，周济源，张鑫，
申请(专利权)人：山东福瑞达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：