【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种四氢嘧啶羟化酶突变体及其在5-羟基四氢嘧啶制备方面的应用，属于合成生物。
技术介绍
1、5-羟基四氢嘧啶(1, 4, 5, 6-四氢-2-甲基-5-羟基-4-嘧啶羧酸)是四氢嘧啶的衍生物，同样具有四氢嘧啶的渗透调节功能，具有在高温、干燥、高渗、冷冻等不良环境中保护和稳定核酸、细胞膜、蛋白质等物质的功能。与四氢嘧啶相比，5-羟基四氢嘧啶对核酸、细胞膜、蛋白等的保护作用更好。在化妆品领域，基于5-羟基四氢嘧啶的渗透保护功能，可以作为保湿剂添加在化妆品中，既能防止皮肤干燥和衰老，又能减少紫外线对皮肤的伤害；在医药领域，5-羟基四氢嘧啶不仅可以加入药物中用于神经系统疾病的治疗，还可以作为化疗过程中健康细胞的保护剂；在基因工程
的应用，5-羟基四氢嘧啶可以提高双链dna的解链温度，因此可以作为聚合酶链式反应的增强剂。
2、在微生物体内，四氢嘧啶羟化酶以fe2+为辅因子，α-酮戊二酸为辅底物，催化四氢嘧啶转化为5-羟基四氢嘧啶，是微生物发酵生产5-羟基四氢嘧啶过程中的关键酶。四氢嘧啶羟化酶的活性对羟基嘧啶的生物合成至关重要，对5-羟基四氢嘧啶的生产制备极其重要。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术目的在于提供一种四氢嘧啶羟化酶突变体及其在5-羟基四氢嘧啶制备方面的应用，通过制备四氢嘧啶羟化酶突变体、构建重组表达菌株及发酵制备5-羟基四氢嘧啶，提高5-羟基四氢嘧啶的合成效率。
2、为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案如下：p>
3、本专利技术提供一种四氢嘧啶羟化酶突变体，其氨基酸序列如seq id no.1所示，核酸序列如seq id no.2所示。
4、进一步的，所述四氢嘧啶羟化酶突变体是由四氢嘧啶羟化酶基因ectd突变得到。
5、进一步的，所述四氢嘧啶羟化酶突变体是根据四氢嘧啶羟化酶基因ectd的三级预测结构及底物四氢嘧啶和辅底物α-酮戊二酸的化学结构，利用生物信息学软件进行模拟突变得到。
6、进一步的，所述四氢嘧啶羟化酶基因ectd的氨基酸序列如seq id no.3所示，核酸序列如seq id no.4。
7、进一步的，所述四氢嘧啶羟化酶基因来源于具有四氢嘧啶分泌特性的喜盐芽孢杆菌halobacillus sp. fl-2423，该菌株于2019年11月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.18783，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
8、本专利技术另提供一种含四氢嘧啶羟化酶突变体的重组表达菌株的构建，该重组表达菌株为bl21（de3）/pet32a（+）-ectdmut-6×his，所用重组表达载体为pet32a（+）-ectdmut-6×his。
9、进一步的，含四氢嘧啶羟化酶突变体的重组表达菌株的构建，包括以下步骤：
10、（1）设计引物ectdmut-f/r，序列分别如seq id no.5和seq id no.6所示，利用高保真聚合酶phanta hs，以四氢嘧啶羟化酶突变体ectdmut为模版，核酸序列如seq id no.2，扩增获得ectdmut-6×his的基因片段；
11、（2）设计引物pet32a（+）-f/r，序列分别如seq id no.7和seq id no.8所示，利用高保真聚合酶phanta hs，以pet32a（+）质粒为模版，扩增获得pet32a（+）线性化片段；
12、（3）利用同源重组酶clonexpress ii one step cloning kit连接ectdmut-6×his的基因片段和pet32a（+）线性化片段，转化dh5α，氨苄抗性筛选，获得重组表达载体pet32a（+）-ectdmut-6×his；
13、（4）将重组表达载体pet32a（+）-ectdmut-6×his转化到大肠杆菌e.coli bl21（de3）中，构建获得重组表达菌株bl21（de3）/pet32a（+）-ectdmut-6×his。
14、本专利技术还提供一种含四氢嘧啶羟化酶突变体重组表达菌株在制备5-羟基四氢嘧啶中的应用，包括以下步骤：
15、（1）种子平板活化：在超净工作台内将重组表达菌株在含有抗性的固体lb培养基的茄形瓶上划线，37℃，恒温培养12h，得活化的种子；
16、（2）种子液培养：将活化的种子接入装有10l种子培养基的发酵罐中，温度37℃，溶氧20-30%，用氨水调控ph为7.0，培养至od 为10，得种子液；
17、（3）表达菌株发酵：将种子液接入装有8l发酵培养基的发酵罐中，温度37℃，溶氧20-30%，用氨水调控ph为7.0，底糖耗完后加入iptg至发酵培养基中iptg浓度为0.1mm/l，流加浓度为500g/l的甘油溶液，调控od的增长速率为2-4/h，od生长至60结束发酵，得发酵后的菌体；
18、（4）离心收集菌体：在夹套内通入循环冷冻水，将发酵后的菌体降温至4℃，于转速10000rpm、温度4℃的条件下离心5min，弃上清，保留菌体，再用4℃预冷的ph为7.0、0.01mpbs缓冲液重悬，于转速10000rpm、温度4℃的条件下离心5min收集湿菌体，将湿菌体置于4℃下保存；
19、（5）菌体预处理：将湿菌体用4℃预冷的ph为7.0、0.02m pbs重悬，配制成湿菌体浓度为500g/l的混悬液，加入羟基酪醇，得混合液，升温至42℃维持10min，降温至35℃，得预处理后的菌体混悬液；
20、（6）催化制备5-羟基四氢嘧啶：将预处理过的菌体混悬液加入反应液中，得混合液，用磷酸和液碱调节ph为7.0，在温度为35℃、溶氧10-20%的条件下发酵，进行补加处理后，结束发酵，得含5-羟基四氢嘧啶的反应液。
21、注：iptg为异丙基-β-d-硫代半乳糖苷。
22、进一步的，步骤（2）中，所述种子培养基成分为：葡萄糖 20.0g/l，蛋白胨 1.5g/l，酵母粉6.8g/l，一水柠檬酸 0.68g/l，磷酸二氢钾1.6g/l，七水硫酸镁 0.68g/l，gpe消泡剂0.33g/l。
23、进一步的，步骤（3）中，按体积计，所述种子液占发酵培养基的10%。
24、进一步的，步骤（3）中，所述发酵培养基成分为：葡萄糖 20.0g/l，蛋白胨 10.5g/l，酵母粉3.8g/l，玉米浆干粉 4.6g/l，一水柠檬酸 2.5g/l，磷酸二氢钾3.8g/l，七水硫酸镁1.5g/l，gpe消泡剂 0.85g/l。
25、进一步的，步骤（5）中，所述混合液中羟基酪醇的浓度为100-200ppm。
26、进一步的，步骤（6）中，所述混合液成分为：四氢嘧啶30-80g/l，ph为7.0的pbs缓冲液0.01m，α-酮戊二酸30-100g/l，硫酸亚铁0.1-0.2g/l，湿菌体50本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种四氢嘧啶羟化酶突变体，其特征在于：该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的四氢嘧啶羟化酶突变体，其特征在于：所述四氢嘧啶羟化酶突变体是由四氢嘧啶羟化酶基因ectD突变得到。
3.根据权利要求2所述的四氢嘧啶羟化酶突变体，其特征在于：所述四氢嘧啶羟化酶基因ectD的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核酸序列如SEQ ID NO.4。
4.根据权利要求2或3所述的四氢嘧啶羟化酶突变体，其特征在于：所述四氢嘧啶羟化酶基因来源于具有四氢嘧啶分泌特性的喜盐芽孢杆菌Halobacillus sp. FL-2423，该菌株于2019年11月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18783，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
5.一种含四氢嘧啶羟化酶突变体的重组表达菌株的构建，其特征在于：该重组表达菌株为BL21（DE3）/pET32a（+）-ectDmut-6×His，所用重组表达载体
6.根据权利要求5所述的含四氢嘧啶羟化酶突变体的重组表达菌株的构建，其特征在于：包括以下步骤：
7.一种四氢嘧啶羟化酶突变体重组表达菌株在制备5-羟基四氢嘧啶中的应用，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的四氢嘧啶羟化酶突变体重组表达菌株在制备5-羟基四氢嘧啶中的应用，其特征在于：步骤（5）中，所述混合液中羟基酪醇的浓度为100-200ppm。
9.根据权利要求7或8所述的四氢嘧啶羟化酶突变体重组表达菌株在制备5-羟基四氢嘧啶中的应用，其特征在于：步骤（6）中，所述混合液成分为：四氢嘧啶30-80g/L，pH为7.0的PBS缓冲液0.01M，α-酮戊二酸30-100g/L，硫酸亚铁0.1-0.2g/L，湿菌体50-200g/L。
10.根据权利要求9所述的四氢嘧啶羟化酶突变体重组表达菌株在制备5-羟基四氢嘧啶中的应用，其特征在于：步骤（6）中，所述补加处理的具体操作为：每隔0.5h取样测定混合液中羟基四氢嘧啶含量和α-酮戊二酸含量，当溶液中α-酮戊二酸浓度小于5g/L时，补加α-酮戊二酸至溶液中α-酮戊二酸的浓度为5g/L，当羟基四氢嘧啶的浓度增长速率小于2（g/L）/h时，升温至42℃发酵2-4h，结束发酵。
...【技术特征摘要】
1.一种四氢嘧啶羟化酶突变体，其特征在于：该突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示，核酸序列如seq id no.2所示。
2.根据权利要求1所述的四氢嘧啶羟化酶突变体，其特征在于：所述四氢嘧啶羟化酶突变体是由四氢嘧啶羟化酶基因ectd突变得到。
3.根据权利要求2所述的四氢嘧啶羟化酶突变体，其特征在于：所述四氢嘧啶羟化酶基因ectd的氨基酸序列如seq id no.3所示，核酸序列如seq id no.4。
4.根据权利要求2或3所述的四氢嘧啶羟化酶突变体，其特征在于：所述四氢嘧啶羟化酶基因来源于具有四氢嘧啶分泌特性的喜盐芽孢杆菌halobacillus sp. fl-2423，该菌株于2019年11月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.18783，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
5.一种含四氢嘧啶羟化酶突变体的重组表达菌株的构建，其特征在于：该重组表达菌株为bl21（de3）/pet32a（+）-ectdmut-6×his，所用重组表达载体为pet32a（+）-ectdmut-6×his。
6.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡红涛，李海军，张杰，徐波，王超，张英华，李珍爱，贾开钰，孙伟，刘超，
申请(专利权)人：山东福瑞达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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