【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物外泌体，具体涉及一种稳定型的甘草外泌体及其制备方法、在抗衰老化妆品中的应用。
技术介绍
1、外泌体(exosomes)是一种由细胞分泌的直径为40～150nm、密度范围为1.09～1.18g/ml的具有双层磷脂膜结构的囊泡样物质。外泌体主要由脂质双层膜和内部的蛋白质、核酸等分子构成。在细胞内，外泌体通常由内质网合成并转运到高尔基体，随后通过外分泌途径释放到细胞外。外泌体可以包含许多生物活性分子，如rna、蛋白质、磷脂、糖类等，这些分子在修复和再生组织中发挥着重要的作用。目前已经从各物种、各类型的细胞培养上清中提取出了外泌体，如神经元细胞、间充质干细胞、成纤维细胞、内皮细胞、巨核细胞等。
2、目前，对动物来源的外泌体研究和应用较多，例如：
3、cn 115957172a提供一种间充质干细胞外泌体组合物，其通过将3-8代的脐带来源的间充质干细胞进行培养后，提取间充质干细胞外泌体，再将该间充质干细胞外泌体与天然抗氧化剂和咪唑基表面活性剂混合，得到间充质干细胞外泌体组合物，其能够高效抑制黑色素合成，减少黑色素累积，延缓皮肤的衰老，具有较好的抗衰老效果。
4、cn 117045530a提供一种用牛奶外泌体负载活性成分的抗衰老面霜及其应用，其通过在牛奶外泌体内负载抗衰老活性成分槲皮素和山奈酚，再复配一些化妆品中常用的基质成分，得到抗衰老面霜。
5、虽然上述动物细胞来源的外泌体表现出较好的抗衰老作用，但其在制备过程中存在提取工艺复杂、产量低等问题(尤其是干细胞来源的外泌体)；同
6、鉴于此，特提出本申请。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术的目的在于提供一种稳定型的甘草外泌体及其制备方法、在抗衰老化妆品中的应用，该甘草外泌体具有优异的抗衰老性能，并通过自组装包封，提高了外泌体的稳定性，使其能够更好的发挥抗衰老功效，应用前景广阔。
2、本专利技术通过以下技术方案实现：
3、甘草，(glycyrrhiza uralensis fisch.)，豆科甘草属多年生草本植物。甘草，是一味常用中药，具有补脾益气、润肺止咳、清热解毒和调和诸药等功效。近年来，甘草也在化妆品领域有广泛的应用，其中甘草提取物对皮肤具有明显的保湿效果，可以提亮肤色，养肤护肤，缓解各种皮肤炎症。另外，甘草提取物对痘痘粉刺具有一定的修复效果，缓解晒伤，防止皮肤受感染。目前，对于甘草的利用主要还局限于植物提取物以及分离得到的活性小分子化合物的应用，而对于甘草外泌体的研究以及其相关性能还没有报道。
4、第一方面，本申请提供一种稳定型的甘草外泌体的制备方法，其包括：
5、将新鲜的甘草用无菌水浸泡后，破碎碾磨，并加入pbs缓冲液，过滤后得到新鲜汁液；
6、对所述新鲜汁液采用梯度离心法去除残渣和细胞碎片，得到外泌体粗提物，将所述外泌体粗体物用含有吐温80的水溶液重悬后，在100000～120000g下进行两次超高速离心，得到纯化后的甘草外泌体；
7、将所述甘草外泌体加入至聚丙烯酸酯纳米颗粒溶液中，于室温、200-400rmp下共孵育1-2h进行自组装包封，随后进行所述超高速离心，得到稳定型的甘草外泌体。
8、进一步地，上述在制备所述外泌体粗提物中，所述梯度离心法包括：
9、将所述新鲜汁液在500-1000g下进行低速离心10-20min，获得上清液；将所述上清液在5000-6000g下离心10-15min，取中间层；将所述中间层在10000-12000g下离心30-40min，将所得上清液用0.2-0.25μm的针头过滤器过滤，得到所述外泌体粗提物。
10、进一步地，上述在制备纯化后的所述甘草外泌体的过程中，所述水溶液中吐温80的浓度为40～50wt％。
11、进一步地，上述在制备纯化后的所述甘草外泌体的过程中，两次超高速离心分别为：
12、在100000～120000g、3-5℃下进行超高速离心80-100min，随后用pbs缓冲液洗涤沉淀后，再次于100000～120000g下进行超高速离心40-50min。
13、进一步地，上述在进行所述自组装包封过程中，所述聚丙烯酸酯纳米颗粒与所述甘草外泌体的质量比为2-4:1。
14、进一步地，上述聚丙烯酸酯纳米颗粒的粒径为30-50nm，分子量为1000-2000da。
15、进一步地，上述在制得纯化后的甘草外泌体后、进行自组装包封前，还包括：
16、将抗衰老活性肽溶解于pbs缓冲液中，与所述甘草外泌体共混后置于电转杯中进行电转，所述电转的电压为350-400v、时间为12-15s、脉冲数为2-3次，得到负载有所述抗衰老活性肽的甘草外泌体。
17、进一步地，上述所述抗衰老活性肽为pep-383，所述pep-383的氨基酸序列为：cys-leu-gln-pro-glu-thr-gly-glu-tyr-arg-cys(seq id no.01)；
18、所述抗衰老活性肽与所述甘草外泌体的质量比为3～5:1。
19、第二方面，本申请提供一种由制备方法制得的稳定型的甘草外泌体。
20、第三方面，本申请提供一种上述稳定型的甘草外泌体在制备抗衰老化妆品中的应用。
21、与现有技术相比，本专利技术至少具有如下技术效果：
22、1.本申请提供的技术方案，通过采用梯度离心法得到外泌体粗提物，随后在提纯过程中加入吐温80后进行超高速离心，能够使得甘草外泌体与提取溶剂更好地接触，增加提纯效率；并且通过修饰外泌体表面，提高了外泌体的稳定性。随后采用聚丙烯酸酯纳米颗粒对纯化后的甘草外泌体进行自组装包封，聚丙烯酸酯纳米颗粒具有良好的稳定性和吸水性能，其水溶液能够在适宜的条件下进行自组装，将甘草外泌体包裹在其中，形成保护性外壳，减少外泌体的降解和损伤，提高甘草外泌体的稳定性，从而保护其内容物免于降解，从而防止某些活性成分快速降解，保障功效的稳定发挥；同时，聚丙烯酸酯纳米颗粒还可增强甘草外泌体的免疫原性，提高其在使用过程中的生物相容度，增强安全性。
23、2.通过研究表明，这种甘草外泌体，相对于甘草提取物，能够有效促进损伤的人皮肤成纤维细胞修复，对人皮肤成纤维细胞具有更强的保护作用；且该甘草外泌体可以弥散吸收，使其中的生物活性分子被目标细胞摄取和吸收，渗透性强。同时，该甘草外泌体能够有效降低衰老小鼠体内的mda的活性，从而发挥优异的抗衰老性能。
24、3.在本申请较佳的技术方案中，为了进一步提升这种稳定型甘草外泌体在抗衰老方面的性能，专利技术人创造性地将抗衰老活性肽通过电转的方式载入到甘草外泌体内，再采用聚丙烯酸酯纳米颗粒进行自组装包封，使得甘草外泌体作为传递载体，其可以与靶细胞的质膜融合或内吞直接进本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种稳定型的甘草外泌体的制备方法，其特征在于，其包括：
2.根据权利要求1所述的稳定型的甘草外泌体的制备方法，其特征在于，在制备所述外泌体粗提物中，所述梯度离心法包括：
3.根据权利要求1所述的稳定型的甘草外泌体的制备方法，其特征在于，在制备纯化后的所述甘草外泌体的过程中，所述水溶液中吐温80的浓度为40～50wt％。
4.根据权利要求3所述的稳定型的甘草外泌体的制备方法，其特征在于，在制备纯化后的所述甘草外泌体的过程中，两次超高速离心分别为：
5.根据权利要求1所述的稳定型的甘草外泌体的制备方法，其特征在于，在进行所述自组装包封过程中，所述聚丙烯酸酯纳米颗粒与所述甘草外泌体的质量比为2-4:1。
6.根据权利要求5所述的稳定型的甘草外泌体的制备方法，其特征在于，所述聚丙烯酸酯纳米颗粒的粒径为30-50nm，分子量为1000-2000Da。
7.根据权利要求1所述的稳定型的甘草外泌体的制备方法，其特征在于，在制得纯化后的甘草外泌体后、进行自组装包封前，还包括：
8.根据权利要求7所述的稳定型的
9.一种根据权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的稳定型的甘草外泌体。
10.一种根据权利要求9所述的稳定型的甘草外泌体在制备抗衰老化妆品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种稳定型的甘草外泌体的制备方法，其特征在于，其包括：
2.根据权利要求1所述的稳定型的甘草外泌体的制备方法，其特征在于，在制备所述外泌体粗提物中，所述梯度离心法包括：
3.根据权利要求1所述的稳定型的甘草外泌体的制备方法，其特征在于，在制备纯化后的所述甘草外泌体的过程中，所述水溶液中吐温80的浓度为40～50wt％。
4.根据权利要求3所述的稳定型的甘草外泌体的制备方法，其特征在于，在制备纯化后的所述甘草外泌体的过程中，两次超高速离心分别为：
5.根据权利要求1所述的稳定型的甘草外泌体的制备方法，其特征在于，在进行所述自组装包封过程中，所述聚丙烯酸酯纳米颗粒与所述甘草外泌体的质量比为2-4:1。
6.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：饶亮明，鲁红标，任增良，谭卫东，康明，
申请(专利权)人：中科湖州应用技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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