【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及功能性食品、药物开发领域，具体涉及一种具有提高溶解度、抗氧化和抗肿瘤活性的果胶酶水解多糖的制备方法及用途。
技术介绍
1、广陈皮，取自茶枝柑( citrus reticulata chachi)的干燥成熟果皮，其具有理气健脾、燥湿化痰之效，临床用于治疗消化不良、痰多咳嗽等。广陈皮化学成分复杂，受采收时间、储存年限和产地等因素的影响，其主要活性成分也会有所变化。其化学成分主要包括挥发油、黄酮类化合物、生物碱、多糖以及其他功能性成分。多糖类物质是自然界含量丰富的重要生物大分子之一，具备免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、降血脂、抗氧化等生物活性。
2、为提高广陈皮的质量，赵福银等人(周鸿立，赵福银，杨秀东等.一种广陈皮清炒炮制加工工艺[p].吉林省:cn115444884a，2022-12-09.)将广陈皮清炒加工得到炒广陈皮，清炒后，香气增强、水分减少，广陈皮质量有所提高。
3、多糖是陈皮的主要成分之一，为了更好地发挥广陈皮的作用，不仅需要提高提取率，同时也要关注对活性的影响。李慧(李慧.陈皮多糖血糖调节作用及其口服液的制备研究[d].西南大学,2020.)采用水提醇沉法提取陈皮粗多糖，最佳提取工艺为：在提取温度95℃下，加入10倍纯化水提取1.5 h，提取3次，过滤，合并提取液并减压浓缩至20%。再加入4倍体积的90%乙醇，静置12 h，沉淀物用无水乙醇、丙酮重复洗涤3次后冷冻干燥，当粗多糖浓度为1.2 mg/ml时，对abts自由基的清除率达到85.
4、高建华等人(高建华,戴思齐,刘家明等.六种果皮原料果胶的理化及凝胶特性比较[j].农业工程学报,2012,28(16):288-292.)采用酸提醇沉法从柚子皮中提取果胶多糖，苏东林等人(苏东林,李培骏,张丽萍等.柑橘果胶高效提取及其酰胺化改性制备[j].中国食品学报,2020,20(10):84-95.)利用超声辅助提取技术从柑橘皮中提取果胶多糖。根据刘闪闪等人的研究(刘闪闪. 柑橘囊衣低聚果胶及其磺化衍生物的制备及活性研究[d].浙江大学,2018.)，得知果胶多糖的分子量和结构对其生物活性有一定程度的影响，且由于分子量较大，溶解程度较低等原因导致果胶多糖的生物利用率较低。另外，根据廖素媚的研究(廖素媚.陈皮多糖的分离纯化、结构表征及其清除自由基活性研究[d].广东药学院,2009.)，陈皮多糖属于果胶多糖。因此，广陈皮多糖也属于果胶多糖之一，具有较大的分子量，导致在水中的溶解度较低。
5、亚硝酸盐作为在肉制品加工中广泛使用的食品添加剂，控制亚硝酸盐含量一直是肉制品安全性的关注点，亚硝酸盐的摄入超出正常范围可能导致身体组织缺氧，从而导致严重的中毒(冯新红,张仲慧,辛世萌等.亚硝酸盐中毒后迟发性脑病一例[j].中国神经免疫学和神经病学杂志,2013,20(05):343.)。若在肉制品中直接添加亚硝酸盐，在酸性条件下可直接进行生成亚硝胺类物质反应。亚硝胺是强致癌物之一，还有致畸性和致突变作用。亚硝胺的种类繁多，可能导致各种癌症，其中食道癌(付凌萌.n-亚硝基化合物对食管细胞的毒性作用机制及维生素c的干预作用研究[d].南京:东南大学，2020.)、胃癌和肝癌是最常见的。因此，清除亚硝酸盐，能有效降低了亚硝酸胺中毒的风险，在一定程度上可预防肿瘤。
6、鉴于广陈皮多糖溶解性差，为充分开发和利用广陈皮，本专利技术提供了一种炒广陈皮果胶酶水解多糖制备方法及用途在一定程度上为抗氧化和抗肿瘤的研究提供参考，也为广陈皮在食品和医药上的进一步研究开发提供理论依据。
技术实现思路
1、因为广陈皮多糖水溶性不好，为充分开发和利用广陈皮，本专利技术旨在提供一种广陈皮多糖酶解产物制备方法及用途。
2、1.一种炒广陈皮多糖酶解产物制备方法及用途，其特征在于，包括以下步骤：
3、(1)取炒广陈皮粉末，用石油醚除去脂溶性成分，水提醇沉法获得水提醇沉多糖；
4、具体步骤为：取炒广陈皮粉末70 g，在提取温度为60℃条件下，以液固比10 ml/g的比例加入石油醚，回流脱脂3 h后抽滤，滤渣用无水乙醇洗涤两遍后干燥待用。取脱脂的炒广陈皮粉末20 g，放入圆底烧瓶中，按照液固比为 30 ml/g 的比加入蒸馏水，90℃提取5h，滤掉滤渣，收集滤液，将提取液浓缩至原提取液体积的1/5，冷却至室温，浓缩提取液中加入无水乙醇直至乙醇浓度达到80%，醇沉24 h，收集沉淀，得到水提醇沉多糖。
5、(2)用果胶酶对水提醇沉多糖进行酶解，得到果胶酶水解多糖，测定酶解前后多糖的溶解度、理化性质和抗氧化活性；
6、具体步骤为：取3 g水提醇沉多糖，以液固比250 ml/g的比例溶解在ph值为4.5的0.2 m醋酸缓冲液中，然后加入1.2 g果胶酶，在50℃下水解4 h后，在90℃下加热10 min使酶失活。溶液以8000 r/min离心15 min后，取上清液浓缩至原提取液体积的1/5，加入无水乙醇至终浓度为80%，醇沉24 h，收集沉淀用超纯水重溶后透析(3500da) 48 h，将透析液进行浓缩，冻干，得到果胶酶水解多糖。
7、(3)采用棉状deae纤维素对果胶酶水解多糖进行分离纯化，依次被超纯水、0.1mol/l、0.2 mol/l、0.3 mol/l nacl溶液进行洗脱，流速为1 ml/min，获得四个多糖组分；
8、具体步骤为： 取1 g果胶酶水解多糖溶解于50 ml超纯水中，湿法上5 cm×50 cm的棉状deae纤维素柱，依次被超纯水、0.1 mol/l、0.2 mol/l、0.3 mol/l nacl溶液进行洗脱，流速为1 ml/min；各组分洗脱液浓缩后流水透析24 h，超纯水透析24 h，浓缩，冷冻干燥；洗脱组分依次命名为sgcp-1、sgcp -2、sgcp-3和sgcp-4。
9、(4)用紫外、红外对(1)和(2)的多糖进行表征，用紫外、红外、马尔文粒度电位分析仪和液相等仪器及刚果红实验对(3)分离纯化的多糖进行表征。
10、(5)水提醇沉多糖水溶液的溶解度为3.13 ± 0.04 mg/ml，纯度为26.33 ±0.13%；果胶酶水解多糖的水溶液的溶解度为17.56 ± 0.05 mg/ml，纯度为38.35 ±0.17%；酶解后粗多糖的溶解度和纯度均有所提高。
11、(6)通过hplc法测定多糖组分sgcp-1、sgcp-2、sgcp-3和sgcp-4的分子量分别为569.177 kda、654.547 kda、441.947 kda和398.329 kda。平均粒径分别为175.9 nm、191.1nm、162.1 nm、147.2 nm。在红外光谱分析中，酶解后的果胶酶水解多糖显示α-d-吡喃糖苷键存在，而sgcp-2、sgcp-3、sgcp-4则显示β-d-吡喃糖苷键，而sgcp-1则含有α-d-吡喃糖苷键。
12、2.在abts自由本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种炒广陈皮多糖酶解产物制备方法，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤1中，取炒广陈皮粉末70 g，提取温度为60℃，以液固比10 mL/g的比例加入石油醚，回流脱脂3 h后抽滤，滤渣用无水乙醇洗涤两遍，干燥待用；取脱脂的炒广陈皮粉末20 g，放入圆底烧瓶中，按照液固比为 30 mL/g 的比例加入蒸馏水，90 ℃提取5 h，过滤，收集滤液，将滤液浓缩至原提取液体积的1/5，冷却至室温，浓缩液中加入无水乙醇直至乙醇浓度达到80%，醇沉24 h，收集沉淀，得到水提醇沉多糖；其水溶液溶解度为3.13 ± 0.04 mg/mL，多糖纯度为26.33 ± 0.13%，糖醛酸含量为41.80 ± 0.25%，蛋白质含量为0.34 ± 0.004%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤2中，取3 g水提醇沉多糖，以液固比250 mL/g的比例溶解在pH值为4.5的0.2 M醋酸缓冲液中，加入1.2 g果胶酶，在50℃下水解4 h，90℃加热10 min使酶失活；以8000 r/min离心15 min后，取上清液浓缩至原提取
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤3中，取1 g果胶酶水解多糖溶解于50 mL超纯水中，湿法上5 cm×50 cm的棉状DEAE纤维素柱，依次用超纯水、0.1 mol/L、0.2mol/L、0.3 mol/L NaCl溶液进行洗脱，流速为1 mL/min；各组分洗脱液浓缩后流水透析24h，超纯水透析24 h，浓缩，冷冻干燥，各组分依次命名为SGCP -1、SGCP -2、SGCP-3和SGCP-4。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，由HPLC法测定多糖SGCP-1、SGCP-2、SGCP-3和SGCP-4的分子量分别为569.177 kDa、654.547 kDa、441.9 47 kDa 和398.329 kDa；平均粒径为：175.9 nm、191.1 nm、162.1 nm、147.2 nm。
6.根据权利要求2-4所述的方法，其特征在于，由红外光谱分析水提醇沉多糖、果胶酶水解多糖和4个多糖组分，得到果胶酶水解多糖存在α-D-吡喃糖苷键，SGCP-2、SGCP-3、SGCP-4存在β-D-吡喃糖苷键，SGCP-1 存在α-D-吡喃糖苷键。
7.根据权利要求2-4所述的多糖的应用，在ABTS自由基清除能力的测定中，水提醇沉多糖、果胶酶水解多糖、SGCP-1、SGCP-2、SGCP-3和SGCP-4的IC50值为0.15 ± 0.01 mg/mL，0.13 ± 0.01 mg/mL，0.54 ± 0.02 mg/mL，0.25 ± 0.01 mg/mL，0.24 ± 0.01 mg/mL，0.12 ± 0.01 mg/mL，酶解后和分离多糖的抗氧化活性均有所提高。
8.根据权利要求2-4所述的多糖的应用，在清除亚硝酸盐活性测定中SGCP-1、SGCP-2、SGCP-3和SGCP-4的IC50值为15.11 ± 0.21 mg/mL，5.44 ± 0.17 mg/mL，2.44 ± 0.14mg/mL，1.34 ± 0.02 mg/mL，其中SGCP-4的活性最好。
9.根据权利要求2-4所述的多糖组分的应用，通过体外生物活性研究了四个多糖组分的抗氧化和抗肿瘤活性，得出SGCP-4组分活性较好，该多糖有望成为抗氧化和抗肿瘤的候选药物，可用于功能性食品和药物的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种炒广陈皮多糖酶解产物制备方法，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤1中，取炒广陈皮粉末70 g，提取温度为60℃，以液固比10 ml/g的比例加入石油醚，回流脱脂3 h后抽滤，滤渣用无水乙醇洗涤两遍，干燥待用；取脱脂的炒广陈皮粉末20 g，放入圆底烧瓶中，按照液固比为 30 ml/g 的比例加入蒸馏水，90 ℃提取5 h，过滤，收集滤液，将滤液浓缩至原提取液体积的1/5，冷却至室温，浓缩液中加入无水乙醇直至乙醇浓度达到80%，醇沉24 h，收集沉淀，得到水提醇沉多糖；其水溶液溶解度为3.13 ± 0.04 mg/ml，多糖纯度为26.33 ± 0.13%，糖醛酸含量为41.80 ± 0.25%，蛋白质含量为0.34 ± 0.004%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤2中，取3 g水提醇沉多糖，以液固比250 ml/g的比例溶解在ph值为4.5的0.2 m醋酸缓冲液中，加入1.2 g果胶酶，在50℃下水解4 h，90℃加热10 min使酶失活；以8000 r/min离心15 min后，取上清液浓缩至原提取液体积的1/5，加入无水乙醇至终浓度为80%，醇沉24 h，收集沉淀，透析48 h，浓缩，冻干，得到果胶酶水解多糖；其水溶液溶解度为17.56 ± 0.05 mg/ml，多糖纯度为38.35 ± 0.17%，糖醛酸含量为28.31 ± 0.36%，蛋白质含量为0.27 ± 0.006%。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤3中，取1 g果胶酶水解多糖溶解于50 ml超纯水中，湿法上5 cm×50 cm的棉状deae纤维素柱，依次用超纯水、0.1 mol/l、0.2mol/l、0.3 mol/l nacl溶液进行洗脱，流速为1 ml/min；各组分洗脱液浓缩后流水透析24h，超纯水透析24 h，浓缩，冷冻干燥，各...
【专利技术属性】
技术研发人员：周鸿立，才妍妍，栾俊，王晓燕，赵福银，
申请(专利权)人：吉林化工学院，
类型：发明
国别省市：
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