【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物病毒检测，具体涉及一种tobrfv的rt-qpcr特异检测引物、rt-qpcr检测方法及应用。
技术介绍
1、番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruit virus，tobrfv)属烟草花叶病毒属，是近年来发现的一种严重为害番茄、辣椒等作物的病毒。感染tobrfv的番茄叶片症状为褪色、花叶、斑驳，偶尔出现叶片变窄，叶片畸形、坏死，花序梗、花萼、叶柄出现坏死性黄斑；番茄果实症状为出现绿色、黄色、褐色斑块及畸形。感染后的辣椒叶片出现黄色斑驳、皱缩，植株矮化，果实出现褐色皱纹，畸形。
2、现有的技术中tobrfv常出现假阴性的情况。特别是在复合侵染的植株中，检测不到tobrfv。市面上检测tobrfv的检测灵敏度不够。
技术实现思路
1、针对现有技术中的问题，本专利技术提供了一种tobrfv的rt-qpcr特异检测引物、rt-qpcr检测方法及应用。
2、本专利技术采用的技术方案如下：
3、一种tobrfv的rt-qpcr特异检测引物，包括正向引物tobrfv-qf1和反向引物tobrfv-qr1；
4、所述tobrfv-qf1的序列为：gcaacggtggctataaggag；
5、所述tobrfv-qr1的序列为：ggaccattgtaaaccggatg。
6、一种rt-qpcr检测方法，包括以下步骤：
7、步骤s1：提取感染tobrfv的植物的总rna，并
8、步骤s2：以步骤s1得到的cdna为模板，同时设置阳性对照、阴性对照以及空白对照，运用权利要求1所述的tobrfv的rt-qpcr特异检测引物对步骤s1得到的cdna、阳性对照、阴性对照以及空白对照进行常规pcr扩增，得到pcr产物；
9、步骤s3：根据得到的pcr产物得到质粒样品；
10、步骤s4：以得到的质粒样品作为模板进行rt-qpcr检测，得到标准曲线，基于标准曲线判断是否含有tobrfv病毒及获取其含量。
11、进一步地，步骤s2中pcr产物的长度为111bp。
12、进一步地，步骤s2中pcr反应体系为：2xaccurate taq master mix(dye plus)ii(常规pcr反应混合物)：12.5ul，tobrfv-qf1：1ul，tobrfv-qr1：1ul，步骤s1得到的cdna：1ul，然后加入rnasa free h2o(无酶无菌水)使总体积达到25ul；
13、反应程序为：预变性94℃，时长30秒；变性温度98℃，时长10秒；退火温度60℃，时长30秒；延伸温度72℃，时长30秒，后延伸温度72℃，时长1分钟，循环数为36。
14、进一步地，步骤s4中进行rt-qpcr反应体系为：2xsp qpcr mix(2×荧光定量qpcr反应混合物)：5ul；tobrfv-qf1：0.4ul；tobrfv-qr1：0.4ul；tample(dna模板)：1ul；depc：3.2ul；
15、反应程序为：反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，40个循环；65℃延伸5s，95℃延伸5s。
16、进一步地，步骤s1合成cdna的详细步骤如下：
17、步骤s101：将总rna样品、gdnaeraser试剂(基因组dna去除试剂)和2xspapkscriptii rt plus master mix(反转录反应混合物)放置在冰上；
18、步骤s102：去除基因组dna反应，并在pcr管内配置以下溶液：总rna：0.1ug；gdnaeraser：1ul；然后添加rnasa free h2o至体系总体积为10ul；将溶液离心后放入pcr仪器中进行反应，反应温度为42℃，孵育时长为2min，反应结束后将pcr管放置在冰上；
19、步骤s103：在pcr管内加入10ul的2xspapkscript ii rt plus master mix试剂，用移液器抽打混匀后进行离心，然后放入pcr仪器内进行反应，反应程序为：50℃，15分钟；85℃，5秒；反应结束后得到cdna。
20、进一步地，所述阳性对照为含有tobrfv的cdna样品，阴性对照为含有番茄花叶病毒的cdna样品，空白对照为双重去离子水。
21、一种tobrfv的rt-qpcr特异检测引物或rt-qpcr检测方法在检测番茄、辣椒以及茄子中tobrfv的应用，包括在番茄、辣椒以及茄子的种子、叶片以及果实中检测tobrfv。
22、一种含有上述tobrfv的rt-qpcr特异检测引物的tobrfv定量pcr检测试剂盒和tobrfv常规pcr检测试剂盒。
23、综上所述，由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：
24、1.本专利技术以梯度稀释的质粒样品为模板分别开展rt-qpcr和常规rt-pcr的灵敏度检测，比较结果表明，rt-qpcr检测tobrfv的灵敏度比常规rt-pcr检测至少提高了1000倍。
25、2.采用本专利技术的检测方法可以在番茄、辣椒以及茄子的种子、叶片以及果实中检测tobrfv，应用范围更广。
26、3.本专利技术pcr产物的长度为111bp，在满足产物长度要求的前提下，产物长度较短，减少了扩增时长，大约缩短了30min。
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1.一种ToBRFV的RT-qPCR特异检测引物，其特征在于：包括正向引物ToBRFV-qF1和反向引物ToBRFV-qR1；
2.一种RT-qPCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种RT-qPCR检测方法，其特征在于：步骤S2中PCR产物的长度为111bp。
4.根据权利要求2-3任一项所述的一种RT-qPCR检测方法，其特征在于：步骤S2中PCR反应体系为：常规PCR反应混合物：12.5uL，ToBRFV-qF1：1uL，ToBRFV-qR1：1uL，步骤S1得到的cDNA：1uL，然后加入无酶无菌水使总体积达到25uL；
5.根据权利要求2-3任一项所述的一种RT-qPCR检测方法，其特征在于：步骤S4中进行RT-qPCR反应体系为：2×荧光定量qPCR反应混合物：5uL；ToBRFV-qF1：0.4uL；ToBRFV-qR1：0.4uL；DNA模板：1uL；无酶无菌水：3.2uL；
6.根据权利要求2-3任一项所述的一种RT-qPCR检测方法，其特征在于：步骤S1合成cDNA的详细
7.根据权利要求2-3任一项所述的一种RT-qPCR检测方法，其特征在于：所述阳性对照为含有ToBRFV的cDNA样品，阴性对照为含有番茄花叶病毒的cDNA样品，空白对照为双重去离子水。
8.一种如权利要求1所述的ToBRFV的RT-qPCR特异检测引物在检测番茄、辣椒以及茄子中ToBRFV的应用，包括在番茄、辣椒以及茄子的种子、叶片以及果实中检测ToBRFV。
9.一种含有权利要求1所述的ToBRFV的RT-qPCR特异检测引物的ToBRFV定量PCR检测试剂盒和ToBRFV常规PCR检测试剂盒。
...【技术特征摘要】
1.一种tobrfv的rt-qpcr特异检测引物，其特征在于：包括正向引物tobrfv-qf1和反向引物tobrfv-qr1；
2.一种rt-qpcr检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种rt-qpcr检测方法，其特征在于：步骤s2中pcr产物的长度为111bp。
4.根据权利要求2-3任一项所述的一种rt-qpcr检测方法，其特征在于：步骤s2中pcr反应体系为：常规pcr反应混合物：12.5ul，tobrfv-qf1：1ul，tobrfv-qr1：1ul，步骤s1得到的cdna：1ul，然后加入无酶无菌水使总体积达到25ul；
5.根据权利要求2-3任一项所述的一种rt-qpcr检测方法，其特征在于：步骤s4中进行rt-qpcr反应体系为：2×荧光定量qpcr反应混合物：5ul；tob...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁天波，褚栋，石俊霞，刘露希，杨益芬，鲁昕，邵宝林，张敏，黄洪，夏国旭，董悦，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：
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