一种适于大肠杆菌高效表达的IsDNA序列、制备方法、重组表达质粒及工程菌技术

本发明专利技术提供了的一种适于大肠杆菌高效表达的IsDNA序列、制备方法、重组表达质粒及工程菌，其表达产物具有高效催化吲哚促进靛蓝形成的作用；基于马蓝植株细胞色素P450mRNA序列(GenbankID：MG857655.1)的核酸和氨基酸序列信息，经过大肠杆菌(E.coli)密码子偏好优化获得；该IsDNA序列经化学合成后，运用亚克隆技术将合成的IsDNA序列插入到质粒pET

【技术实现步骤摘要】
一种适于大肠杆菌高效表达的IsDNA序列、制备方法、重组表达质粒及工程菌


[0001]本专利技术涉及生物技术、食品添加剂及染料制造
，具体涉及一种适于大肠杆菌高效表达的IsDNA序列、制备方法、重组表达质粒及工程菌。

技术介绍

[0002]靛蓝是色素中基本三原色之一，是一种重要的化工染料和食品色素添加剂。作为化工染料全球年需求量在8
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80万吨之间，主要来源于化学合成。随着人们生活水平的提高和健康意识能力的增强，对于化学合成所需的有毒原料(苯胺、硝基苯、邻苯二甲酸酐等)及其产品均有较全面的了解，人们逐渐地认识到化学染料制成的织物产品对身体健康的危害。古老的靛蓝色素虽然在我国已经使用了2000多年了，且传统的提取工艺方法成熟。但是天然靛蓝来源极少，尽管能提取靛蓝的植物较多，如木蓝、菘蓝、蓼蓝、马蓝等，然而其靛蓝含量低，根本无法满足现代化工艺生产和市场的需要。寻找天然靛蓝的来源，优化和更新工艺提取方法，获得更多的天然靛蓝，以满足人们需要，既符合人类对天然、绿色、健康的追求目标，又符合全球生态保护、环境友好的发展理念。
[0003]现已发现，多种微生物在自然界可以合成靛蓝，如Pseudomonas sp.，Acinetobacter sp.，Bacillus megatreium等等。众多学者由此深受启发，如果能开发微生物合成靛蓝，这样就可以不受资源限制。如果能洞察靛蓝在微生物中的合成通路，分析靛蓝在微生物细胞中的合成机制，并以此对微生物进行人工改造，提高靛蓝的产量，就可以降低生产成本。运用微生物合成天然靛蓝色素，将成为淘汰化学合成有害色素的有效途径，是未来天然色素生产的发展趋势。目前，已有研究报道靛蓝色素是通过不同的酶作用于吲哚，使其发生氧化反应来实现，当该酶为单加氧酶时，其产物为靛蓝色素，当该酶为双加氧酶时，其产物为靛蓝和靛玉红混合色素。由于自然界中野生菌株产生靛蓝色素的量只是满足菌株自身生长的需要，因此靛蓝色素的生物转化量非常低。国内外学者通过分子生物学技术对不同的加氧酶(如萘双加氧酶、苯酚羟化酶、二甲苯单加氧酶、黄素蛋白单加氧酶、细胞色素P450单加氧酶、铜依赖单加氧酶等等)进行克隆，并构建工程菌进行合成靛蓝色素方面的研究，但其合成产量并不理想，只能说明通过加氧酶的克隆表达在细菌细胞内能合成靛蓝色素。尽管有些公司利用代谢工程的手段对合成途径及关键基因进行了优化改造，并取得了一定的效果，但终因资源、成本及技术等多方面因素的限制，微生物合成靛蓝工业化最终未能实现。因此，研究开发高产、稳定合成靛蓝的关键酶，构建高效合成靛蓝的工程菌，实现天然靛蓝的工业化合成，以满足人类生产生活及身体健康的需要，具有重大意义。
[0004]细胞色素P450单加氧酶广泛动物植物微生物中,在微生物合成靛蓝的研究中，以P450BM
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3研究较多，普遍认为野生型的细胞色素P450单加氧酶不直接催化合成吲哚酚，大都是将细胞色素P450单加氧酶基因做了优化后才可以催化合成吲哚酚，进而形成靛蓝，目前也未见有细胞色素P450单加氧酶基因优化后序列的报道。关于植物中的细胞色素P450单加氧酶催化合成吲哚酚，进而形成靛蓝的研究，报道极少。
[0005]综上所述，急需一种能高产、稳定合成靛蓝的关键酶的、适于大肠杆菌高效表达的IsDNA序列、制备方法、重组表达质粒及工程菌以解决现有技术中存在的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种适于大肠杆菌高效表达的IsDNA序列，具体方案如下：
[0007]一种适于大肠杆菌高效表达的IsDNA序列，所述IsDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]本专利技术还提供一种IsDNA序列的制备方法，用于制备上述IsDNA序列，包括如下步骤：对Genbank ID为MG857655.1的马蓝细胞色素P450单加氧酶基因进行分析编码，并根据大肠杆菌的偏好性进行密码子偏好优化，得到IsDNA序列。
[0009]优选的，经大肠杆菌的偏好性进行密码子偏好优化的参数具体包括：
[0010]1)所述IsDNA序列的密码子适应指数CAI优化前为0.67，优化后为0.97；
[0011]2)所述IsDNA序列中的碱基GC含量优化前以及优化后均为0.5；
[0012]3)所述IsDNA序列优化前含有NcoI、XhoI、SacI和EcoR I限制性内切酶识别位点，优化后不含NcoI、XhoI、SacI和EcoR I限制性内切酶识别位点；所述IsDNA序列的回避序列优化后移除了2个AATAAA碱基序列和1个ATTAAA碱基序列；
[0013]4)删除所述IsDNA的重复序列；优化前重复序列的最大正向和最大反向长度均为12bp，优化后最大反向长度为14bp。
[0014]本专利技术还提供了一种表达IsDNA序列的重组表达质粒，含有上述IsDNA序列，所述表达IsDNA序列的重组表达质粒为pET
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22b
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IsDNA，得到所述表达IsDNA序列的重组表达质粒的过程为：选取质粒pET
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22b；在IsDNA序列的两端分别加上限制性内切酶NdeI和HindIII位点识别序列5
’‑
CATATG
‑3’
和5
’‑
AAGCTT
‑3’
；使用限制性内切酶NdeI和HindIII对pET
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22b进行双酶切；将双酶切后的pET
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22b与IsDNA序列进行重组，得到表达IsDNA的重组表达质粒。
[0015]本专利技术还提供了一种表达IsDNA序列的工程菌，所述的工程菌含有上述IsDNA序列或重组表达质粒。
[0016]优选的，所述含有IsDNA序列的工程菌为BL21(DE3)/IsDNA，通过如下制备步骤制得：选取大肠杆菌BL21(DE3)；利用热击转化方法将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到表达IsDNA的工程菌。
[0017]优选的，所述表达IsDNA的工程菌在生产天然的靛蓝色素中的应用。
[0018]应用本专利技术的技术方案，具有以下有益效果：
[0019](1)本专利技术的IsDNA序列基于马蓝细胞色素P450单加氧酶基因序列，经过大肠杆菌(E.coli)密码子偏好优化所得。该基因序列能够在大肠杆菌中高效表达，进而可以实现天然的靛蓝色素的工业化生产。
[0020](2)本专利技术的IsDNA序列是自然界中不存在的DNA序列，该序列能借助原核表达载体(质粒)实现在BL21(DE3)中高效表达产物，产物利用吲哚为底物催化合成天然靛蓝色素。本专利技术得到的工程菌株，为天然靛蓝色素生物合成的工业化定向设计奠定基础。
[0021]除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本专利技术还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本专利技术作进一步详细的说明。
附图说明
[0022]构成本申请的一部分的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适于大肠杆菌高效表达的IsDNA序列，其特征在于，所述IsDNA序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种IsDNA序列的制备方法，其特征在于，用于制备如权利要求1所述的IsDNA序列，包括如下步骤：对Genbank ID为MG857655.1的马蓝细胞色素P450单加氧酶基因进行分析编码，并根据大肠杆菌的偏好性进行密码子偏好优化，得到IsDNA序列。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，经大肠杆菌的偏好性进行密码子偏好优化的参数具体包括：1)所述IsDNA序列的密码子适应指数CAI优化前为0.67，优化后为0.97；2)所述IsDNA序列中的碱基GC含量优化前以及优化后均为0.5；3)所述IsDNA序列优化前含有NcoI、XhoI、SacI和EcoR I限制性内切酶识别位点，优化后不含NcoI、XhoI、SacI和EcoR I限制性内切酶识别位点；所述IsDNA序列的回避序列优化后移除了2个AATAAA碱基序列和1个ATTAAA碱基序列；4)删除所述IsDNA的重复序列；优化前重复序列的最大正向和最大反向长度均为12bp，优化后最大反向长度为14bp。4.一种表达IsDNA序列的重组表达质粒，其特征在于，含有如权利要求1所述的IsDNA序列，所述表达IsDNA序列的重组表达质粒为pET

【专利技术属性】
技术研发人员：魏麟，何彰华，袁小黎，
申请(专利权)人：湖南道生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：