一种生产靛蓝色素的工程菌制造技术

本发明专利技术提供了一种生产靛蓝色素的工程菌，具有利用培养基中的营养成分高效生产靛蓝色素的功能。该工程菌基于大肠杆菌色氨酸合成途径及添加色氨酸到靛蓝色素形成的关键酶基因，应用基因编辑和分子克隆技术对合成途径进行分子遗传改造，整合改造后的DNA为一条从培养基营养成分形成靛蓝色素的便捷通路。改造后获得的工程菌可直接应用于靛蓝色素生物合成，为后续工业化生产靛蓝色素奠定基础。后续工业化生产靛蓝色素奠定基础。后续工业化生产靛蓝色素奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种生产靛蓝色素的工程菌


[0001]本专利技术涉及生物技术、食品添加剂及染料制造
，具体涉及一种生产靛蓝色素的工程菌。

技术介绍

[0002]靛蓝是在我国已经具有几千年历史的传承经典，从不衰退。只是社会在前进。科技在进步，如今的靛蓝色素绝大部分来自于化学合成，只有极少数来自于植物生产天然靛蓝，也只有极少数人能享受到由天然靛蓝色素加工而来绿色产品。大部分人在生活中穿着含有苯胺、硝基苯、邻苯二甲酸酐等有毒成分的化学合成靛蓝染料染色而成的衣服，吃着化学合成色素染色的食物，虽然这些色素的使用及其有毒物质含量在国家文件规定及政策许可的范围，但是，长期使用会对人体造成危害，甚至致病，严重影响人类身体健康。随着人们生活水平的提高和健康意识能力的增强，寻求更健康、更环保的绿色天然靛蓝色素，回归自然的健康原生态，已经成为人们的企盼。
[0003]绿色天然靛蓝色素既可以来自木蓝、菘蓝、蓼蓝、马蓝等植物，又可以来自Pseudomonassp.，Acinetobacter sp.，Bacillus megatreium等微生物。来自于植物的靛蓝具有古老、经典等特色，其产量较低，提取出来的天然靛蓝产量仅仅是原材料的1％
‑
2％不等。即使许多学者在提取技术方法上不断改进，以及应用分子生物学技术对植株进行转基因研究，其效果也不尽人意，最终的产量还是保持原有的现状。人们只能通过大规模种植相应植物，以此增加生物量来换取更多的天然靛蓝色素，但是，这种方式带来的经济效益又大打折扣。研究者和企业家将目光转向了微生物，微生物如何合成靛蓝色素深受研究者们的青睐，微生物合成靛蓝色素的文献被大量报道，目前已知晓微生物生成靛蓝的大概路径，并且研究了许多微生物中的加氧酶，如萘双加氧酶、苯酚羟化酶、二甲苯单加氧酶、黄素蛋白单加氧酶、细胞色素P450单加氧酶、铜依赖单加氧酶等等，以及多种酶的作用及其作用机制。同时，也有一些研究者构建工程菌进行合成靛蓝色素方面的研究，利用代谢工程手段对合成途径及关键基因进行了优化改造，并取得了一定的效果，但终因资源、成本及技术等多方面因素的限制，微生物合成靛蓝工业化最终未能实现。
[0004]从实验室研究的角度，根据已报道的文献及专利来看，有研究以吲哚为底物合成靛蓝色素的，也有研究以色氨酸为底物合成靛蓝色素的，却未见有经过基因组DNA改造，直接利用培养基中的营养成分(如碳源、氮源等)合成靛蓝色素的工程菌。
[0005]综上所述，急需一种生产靛蓝色素的工程菌以解决现有技术中存在的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的在于提供一种生产靛蓝色素的工程菌，具体技术方案如下：
[0007]一种生产靛蓝色素的工程菌，所述工程菌为BL21 (DE3/trpR
‑
/TnaA
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Opt
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CYP450+/Amp+)，获得该工程菌的具体过程为：
[0008]选择大肠杆菌BL21(DE3)；
[0009]使用CRISPR/Cas9技术，利用gRNA靶向trpR基因，将trpR基因序列剪断；
[0010]利用λRED同源重组酶将供体DNA通过同源重组方法插入TrpR基因中，得到该工程菌；所述供体DNA包括trpR上游同源臂、启动子、TnaA
‑
Opt
‑
CYP450融合基因、Amp 抗性基因、终止子以及trpR下游同源臂；所述TnaA
‑
Opt
‑
CYP450融合基因序列如SEQ IDNo.1所示。
[0011]优选的，所述供体DNA的制备过程具体如下：
[0012]将TnaA
‑
Opt
‑
CYP450融合基因克隆构建至原核表达载体pET
‑
22b中，获得重组表达质粒pET
‑
22b
‑
TnaA
‑
Opt
‑
CYP450；
[0013]分别设计引物，以pET
‑
22b
‑
TnaA
‑
Opt
‑
CYP450为模板，供体引物F2/R2进行PCR获取启动子、终止子、TnaA
‑
Opt
‑
CYP450融合基因和Amp抗性基因；
[0014]以大肠杆菌基因组为模板，供体引物F1/R1和供体引物F3/R3进行PCR获取trpR上游同源臂、trpR下游同源臂；
[0015]再通过PCR获得供体DNA。
[0016]优选的，所述TnaA
‑
Opt
‑
CYP450融合基因包括TnaA基因与Opt
‑
CYP450基因，所述 TnaA基因的Genbank ID为NC_000913.3；所述Opt
‑
CYP450基因为基于Genbank ID为 MG857655.1的马蓝细胞色素CYP450mRNA序列的核酸和氨基酸序列信息经过分析编码并根据大肠杆菌的密码子偏好优化后所得，所述Opt
‑
CYP450基因序列如SEQ ID No.4所示。
[0017]优选的，所述Opt
‑
CYP450基因序列经过大肠杆菌的密码子偏好优化的参数具体包括：
[0018]1)所述Opt
‑
CYP450序列的密码子适应指数CAI优化前为0.67，优化后为0.97；
[0019]2)所述Opt
‑
CYP450序列中的碱基GC含量优化前以及优化后均为0.5；
[0020]3)所述Opt
‑
CYP450序列优化前含有NcoI、XhoI、SacI和EcoRI限制性内切酶识别位点，优化后不含NcoI、XhoI、SacI和EcoR I限制性内切酶识别位点；所述IsDNA序列的回避序列优化后移除了2个AATAAA碱基序列和1个ATTAAA碱基序列；
[0021]4)删除所述Opt
‑
CYP450的重复序列；优化前重复序列的最大正向和最大反向长度均为12bp，优化后最大反向长度为14bp。
[0022]优选的，所述的工程菌应用于工业生产天然的靛蓝色素。
[0023]应用本专利技术的技术方案，具有以下有益效果：
[0024](1)本专利技术提供的一种生产靛蓝色素的工程菌，通过以大肠杆菌BL21为底盘细胞，基于同源色氨酸酶TnaA基因序列和Opt
‑
CYP450基因，通过gRNA和λRED的组合作用，将供体DNA通过同源重组方法插入TrpR基因中，得到该工程菌；所述供体DNA包括trpR 上游同源臂、启动子、TnaA
‑
Opt
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CYP450融合基因、Amp抗性基因、终止子以及trpR下游同源臂；改造后的工程菌株产生天然靛蓝色素染料，为靛蓝生物合成的工业化生产提供菌种。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产靛蓝色素的工程菌，其特征在于，所述工程菌为BL21(DE3/trpR
‑
/TnaA
‑
Opt
‑
CYP450+/Amp
+
)，获得该工程菌的具体过程为：选择大肠杆菌BL21(DE3)；使用CRISPR/Cas9技术，利用gRNA靶向trpR基因，将trpR基因序列剪断；利用λRED同源重组酶将供体DNA通过同源重组方法插入TrpR基因中，得到该工程菌；所述供体DNA包括trpR上游同源臂、启动子、TnaA
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Opt
‑
CYP450融合基因、Amp抗性基因、终止子以及trpR下游同源臂；所述TnaA
‑
Opt
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CYP450融合基因序列如SEQ ID No.1所示；所述供体DNA序列如SEQ ID No.2所示。2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述供体DNA的制备过程具体如下：将TnaA
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Opt
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CYP450融合基因克隆构建至原核表达载体pET
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22b中，获得重组表达质粒pET
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22b
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TnaA
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Opt
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CYP450；分别设计引物，以pET
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22b
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TnaA
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Opt
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CYP450为模板，供体引物F2/R2进行PCR获取启动子、终止子、TnaA
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Opt
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CYP450融合基因和Amp抗性基因；以大肠杆菌基因组为模板，供...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏麟，何彰华，袁小黎，
申请(专利权)人：湖南道生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：