一种分泌型重组人生长激素工程菌高密度发酵工艺制造技术

本发明专利技术提供一种分泌型重组人生长激素工程菌的发酵工艺，该工艺通过发酵温度、PH和PO等参数调整进而控制工艺优化，提高重组人生长激素工程菌的蛋白表达，提高发酵设备和原料的利用率。利用率。利用率。

【技术实现步骤摘要】
一种分泌型重组人生长激素工程菌高密度发酵工艺


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种分泌型重组人生长激素工程菌高密度发酵工艺。

技术介绍

[0002]人生长激素(rhGH)是人内源性激素，是脑垂体前叶分泌的一种蛋白类激素，含有191个氨基酸，分子量为22Kd。重组人生长激素(rhGH)是利用基因工程方法将人类生长激素基因从染色体DNA链上分离出来，重组到质粒上，并用不同的表达体系表达的重组蛋白。rhGH的氨基酸含量、空间构象及序列与人生长激素完全相同，具有与人体内源性生长激素等同的生物学作用。临床上主要应用千治疗或缓解因生长激素(GH)分泌不足或缺乏而导致的儿童矮小症、组织修复、烧烫伤、成人生长激素缺乏(GHD)等。
[0003]目前人生长激素已经分别在大肠杆菌、酵母及哺乳动物细胞中获得成功表达，但现有技术的重组人生长激素发酵工艺目前还不十分成熟，产量低、生产成本高，无法满足临床的大量需求。
[0004]大肠杆菌是用于表达异源蛋白最常用的宿主。大肠杆菌的高密度发酵技术还不成熟。据文献报道的两个最高菌密度分别为174g(DCW)/L和175.5g(DCW)/L，而利用批式发酵技术所达到的菌密度不到10g(DCW)/L。当然不同的菌株，其间应存在着差别。据文献报道，人生长激素的融合蛋白胞内表达可达1.08g/L，但这种蛋白的氮端多了几个氨基酸，需要进行体外剪切。另据报道，以包涵体形式表达的人生长激素可达1.75g/L，其氮端比天然生长激素多了一个蛋氨酸。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，为解决以上不足，本专利技术提供一种分泌型重组人生长激素工程菌的发酵工艺，可提高重组人生长激素工程菌的蛋白表达，提高发酵设备和原料的利用率。
[0006]一种分泌型重组人生长激素工程菌的高密度发酵工艺，所述发酵工艺如下：
[0007]S1菌种摇瓶培养：采用LB培养基为基础，接入构建基因工程菌进行菌种培养，一级接种量为1：250，二级接种量为1：190，获得液体发酵菌种；
[0008]S2配制发酵罐内培养基：磷酸氢二钠0.1％，磷酸二氢钠0.5％，氯化钾，硫酸镁0.3％等，微量元素0.02％，酸水解酪蛋白0.5％，酵母提取物0.5％，补料流加50％葡萄糖和酪素；
[0009]S3发酵：将上述所得发酵培养基灭菌之后，接入所得液体发酵菌种，发酵培养温度37度，pH值7.0，溶解氧100％；进入对数生长期后，通过调节空气流量和搅拌转速控制溶氧浓度至少为20％，当OD600达到30左右时，通入医用氧确保溶解氧始终保持在20％以上，当pH值降至7.0时候；通过流加25％(v/v)氨水使得pH值维持在7.0；当OD600达到65左右时，流加50％葡糖糖量此时达到最大值，当OD600达到90左右时，流加50％葡萄糖为最大值的一半左右；当OD600稳定在95左右，稳定期为8h左右，可以放罐收集菌体；
[0010]S4收集菌体：将发酵液接入管式离心机16000rpm，得到菌体，存放于
‑
80度储存，破碎后分离纯化得到目标蛋白。
[0011]优选的是，所述LB培养基包括以下重量计成分：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，配制2000ml菌种培养基。
[0012]优选的是，所述S1中微量元素为Fe、Zn、Mn、Cu、Co、Ca。
[0013]优选的是，所述S1中所述酪素为酸水解酪蛋白0.25％、酶水解蛋白0.75％、酵母提取物0.5％。
[0014]与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：
[0015]1、本专利技术提供一种分泌型重组人生长激素工程菌的发酵工艺，该工艺通过发酵温度、PH和PO等参数调整进而控制工艺优化，提高重组人生长激素工程菌的蛋白表达，提高发酵设备和原料的利用率；
[0016]2、本专利技术采用碱性磷酸酶启动子，发酵培养基采用磷酸氢二钠0.1％，磷酸二氢钠0.5％的比例，磷酸盐过量HGH无表达，磷酸盐不足，达不到高密度发酵。
附图说明
[0017]此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
[0018]图1为工程菌高密度发酵生产曲线图。
[0019]图2为图1中最高点(OD值)的蛋白高电泳图。
[0020]图2中：1全菌体电泳；2裂解液电泳；3盐析液电泳；4、5、6、7均为标准品电泳。
具体实施方式
[0021]以下由特定的具体实施例说明本专利技术的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0022]下面结合附图和具体的实施例对本专利技术做进一步详细说明，所述是对本专利技术的解释而不是限定。
[0023]一种分泌型重组人生长激素工程菌的高密度发酵工艺，所述发酵工艺如下：
[0024]S1菌种摇瓶培养：采用LB培养基，蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，配制2000ml菌种培养基，接入构建基因工程菌进行菌种培养，一级接种量为1：250，二级接种量为1：190，获得液体发酵菌种，具体为：本研究主要运用大肠杆菌w3110，用表达质粒转化W3110大肠杆菌菌株得到的工程菌，命名为PS
‑
hGH，对人生长激素进行胞间质可溶性表达，其一级结构与天然蛋白完全一致，且直接分泌到细胞周质中，有利于提纯，并通过大量优化工程菌的培养条件，实现了工程菌的稳定培养和高水平表达，实现了重组人生长激素(rhGH)的大规模生产。
[0025]S2配制发酵罐内培养基：磷酸氢二钠0.1％，磷酸二氢钠0.5％，氯化钾，硫酸镁0.3％等，微量元素(Fe、Zn、Mn、cu、co、ca)0.02％，酸水解酪蛋白0.5％，酵母提取物0.5％，补料流加50％葡萄糖和酪素(酸水解酪蛋白0.25％，酶水解蛋白0.75％，酵母提取物
0.5％)。
[0026]S3发酵：将上述所得发酵培养基灭菌之后，接入所得液体发酵菌种，发酵培养温度37度，pH值7.0，溶解氧100％；进入对数生长期后，通过调节空气流量和搅拌转速控制溶氧浓度至少在20％以上，当OD600达到30左右时，比生长速率达到最大，空气流量和搅拌转速均达到最大值，溶解氧供应不足，此时通入医用氧(14.5mpa)确保溶解氧始终保持在20％以上，当pH值降至7.0时候，通过流加25％(v/v)氨水使得pH值维持在7.0。当OD600达到65左右时，流加50％葡糖糖量此时达到最大值，此时发酵培养基中磷酸盐含量基本耗尽，细菌不在进行分裂繁殖，碱性磷酸酶启动子开始启动，目的蛋白开始表达，为确保因葡糖糖流加过量而形成乙酸积累影响目的蛋白表达，此刻开始调控50％葡萄糖流加量逐渐减少；当OD600达到90左本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分泌型重组人生长激素工程菌的高密度发酵工艺，其特征在于，所述发酵工艺如下：S1菌种摇瓶培养：采用LB培养基为基础，接入构建基因工程菌进行菌种培养，一级接种量为1：250，二级接种量为1：190，获得液体发酵菌种；S2配制发酵罐内培养基：磷酸氢二钠0.1％，磷酸二氢钠0.5％，氯化钾，硫酸镁0.3％等，微量元素0.02％，酸水解酪蛋白0.5％，酵母提取物0.5％，补料流加50％葡萄糖和酪素；S3发酵：将上述所得发酵培养基灭菌之后，接入所得液体发酵菌种，发酵培养温度37度，pH值7.0，溶解氧100％；进入对数生长期后，通过调节空气流量和搅拌转速控制溶氧浓度至少为20％，当OD600达到30左右时，通入医用氧确保溶解氧始终保持在20％以上，当pH值降至7.0时候；通过流加25％(v/v)氨水使得pH值维持在7.0；当OD600达到65左右时，流加50％葡糖糖量此时达...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晓峰，
申请(专利权)人：长春赛恩生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：