大肠杆菌重组菌及利用大肠杆菌重组菌生产3,4-二羟基苯乙醇的方法技术

本发明专利技术提供了大肠杆菌重组菌及利用大肠杆菌重组菌生产3,4

【技术实现步骤摘要】
大肠杆菌重组菌及利用大肠杆菌重组菌生产3,4
‑
二羟基苯乙醇的方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
领域，具体而言，涉及一种大肠杆菌重组菌及利用大肠杆菌重组菌生产3,4
‑
二羟基苯乙醇的方法。

技术介绍

[0002]3,4
‑
二羟基苯乙醇，又名羟基酪醇，分子式C8H
10
O3，是天然多酚类化合物，主要来源于橄榄树及其叶子，具有很强的抗氧化性。有研究表明3,4
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二羟基苯乙醇可以减缓皮肤衰老，提高机体免疫能力，恢复人体肺腑器官的健康状态；另外，3,4
‑
二羟基苯乙醇在抗菌，抗病毒，抑制癌症发生等方面也有一定的积极作用。因此，3,4
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二羟基苯乙醇的制备与生产具有一定的使用价值与经济效益。
[0003]3,4
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二羟基苯乙醇制备的方法目前有植物提取、化学合成以及生物合成。3,4
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二羟基苯乙醇的植物提取方法主要是从橄榄树或叶片中萃取出来。萃取过程中需要用到乙醇、正丁醇、石油醚等易燃易爆的有机试剂，并且收率很低，同时伴随着大量副产物的产生，导致3,4
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二羟基苯乙醇纯度偏低；3,4
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二羟基苯乙醇的化学合成方法主要是用化学原材料在有机溶剂中反应获得，例如，许超等公开了3,4
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二羟基苯乙醇的合成方法，报道了以邻苯二酚为原料，经过保护邻二酚羟基，溴化制得3,4
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亚甲二氧基溴苯,制备其格氏试剂,再用格氏试剂与环氧乙烷反应,最后脱掉保护基团，以5步反应总收率24％得到高纯度3,4
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二羟基苯乙醇，但最终收率仍比较低，且成本比较高；3,4
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二羟基苯乙醇的生物合成方法主要是利用重组大肠杆菌或基因组改造的酵母菌代谢合成3,4
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二羟基苯乙醇，例如，中国专利CN114350717A公开的一种生物酶催化制备3,4
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二羟基苯乙醇的方法，其中报道了利用诱导后产酶的重组大肠杆菌，以对羟基苯乙醇为底物生物合成3,4
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二羟基苯乙醇的方法，3,4
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二羟基苯乙醇产量达到13g/L，对羟基苯乙醇价格较为昂贵，限制其工业化生产；此外，对羟基苯乙醇来源于石化产品，相对于可再生的生物基材质，其在食品、保健品、化妆品等高端应用场景有一定的使用局限性。
[0004]综上，利用生物合成技术合成3,4
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二羟基苯乙醇可以大量减少有机溶剂的使用，以及减小对环境的损害，但现有生物合成方法以来源于石化产品的对羟基苯乙醇为底物，使得产品3,4
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二羟基苯乙醇在食品、保健品、化妆品等高端应用场景的应用有所局限，所以开发一种在食品、保健品、化妆品领域更易于被消费者认可接受的3,4
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二羟基苯乙醇的加工方法、或可应用在该方法中的工程菌尤其必要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种大肠杆菌重组菌及利用大肠杆菌重组菌生产3,4
‑
二羟基苯乙醇的方法。能够以生物基来源的酪氨酸为底物生产3,4
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二羟基苯乙醇，在食品、保健品、化妆品领域更易于被消费者认可接受。
[0006]第一方面，本专利技术提供一种大肠杆菌重组菌，该菌同时共表达四种酶，分别为酪氨
酸酶、L
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氨基酸氧化酶、酮酸脱羧酶和醇脱氢酶。
[0007]在可选的实施方式中，采用pETDuet
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1和pCDFduet
‑
1双质粒共表达四基因：pETduet
‑
1装载酪氨酸酶和L
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氨基酸氧化酶，pCDFduet
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1装载酮酸脱羧酶和醇脱氢酶基因。
[0008]第二方面，本专利技术提供一种利用大肠杆菌重组菌生产3,4
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二羟基苯乙醇的方法，利用大肠杆菌重组菌，以酪氨酸为底物生产3,4
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二羟基苯乙醇。
[0009]在可选的实施方式中，向培养基中加入大肠杆菌重组菌种子液，和IPTG，然后添加底物酪氨酸和碳源，发酵得到3,4
‑
二羟基苯乙醇；所述酪氨酸的添加总量为10
‑
50g/L，酪氨酸添加速率为1
‑
10g/(L*h)，按重量计所述酪氨酸和碳源的添加速率比为0.5
‑
3；
[0010]优选地，IPTG添加终浓度为0.4
‑
0.6mM，碳源为葡萄糖。
[0011]优选地，所述底物酪氨酸添加总量为25
‑
30g/L，底物酪氨酸添加速率为3
‑
5g/(L*h)，按重量计所述酪氨酸和葡萄糖的添加速率比为1
‑
1.2。
[0012]在可选的实施方式中，发酵过程中发酵液温度为25
‑
32℃、pH为5.5
‑
7.5，添加IPTG时发酵液中菌体OD
600nm
≥10。
[0013]在可选的实施方式中，发酵过程中发酵液温度为28
‑
30℃、pH值为6.5～7.0。
[0014]在可选的实施方式中，当培养基中菌体OD
600nm
<10时，使培养基在35
‑
40℃、pH6.5
‑
7.5条件下培养大肠杆菌重组菌至菌体OD
600nm
≥10，然后向其中添加IPTG。
[0015]在可选的实施方式中，培养基包括蛋白胨10
‑
15g/L、酵母粉20
‑
25g/L、甘油9
‑
11g/L、磷酸二氢钾2
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2.5g/L、磷酸氢二钾12
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13g/L和维生素C4.5
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5.5g/L。
[0016]在可选的实施方式中，培养基是将蛋白胨、酵母粉、甘油、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾混合灭菌后加入维生素C，并调节至pH6.5
‑
7.5得到。
[0017]在可选的实施方式中，选择氨水调节至培养基pH6.5
‑
7.5。
[0018]在可选的实施方式中，所述大肠杆菌重组菌种子液是将大肠杆菌重组菌置于培养液中，并于35
‑
40℃、pH6.5
‑
7.5培养8
‑
16h得到，所述培养液包括蛋白胨8
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12g/L，酵母提取物4
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6g/L，NaCl9
‑
11g/L，甘油4
‑
6g/L。
[0019]本专利技术实施例的有益效果是：
[0020]本专利技术实施例发酵过程中所用的底物为酪氨酸，酪氨酸廉价易得，且大多数为生物基来源，不依赖于石本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌重组菌，其特征在于，该菌共表达四种酶，分别为酪氨酸酶、L
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氨基酸氧化酶、酮酸脱羧酶和醇脱氢酶。2.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，采用pETDuet
‑
1和pCDFduet
‑
1双质粒共表达四基因：pETduet
‑
1装载酪氨酸酶和L
‑
氨基酸氧化酶，pCDFduet
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1装载酮酸脱羧酶和醇脱氢酶基因。3.一种利用权利要求1所述的大肠杆菌重组菌生产3,4
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二羟基苯乙醇的方法，其特征在于，利用大肠杆菌重组菌，以酪氨酸为底物生产3,4
‑
二羟基苯乙醇。4.根据权利要求3所述的利用大肠杆菌重组菌生产3,4
‑
二羟基苯乙醇的方法，其特征在于，向培养基中加入大肠杆菌重组菌种子液和IPTG，然后添加酪氨酸和碳源，发酵得到3,4
‑
二羟基苯乙醇；所述酪氨酸的添加总量为10
‑
50g/L，酪氨酸添加速率为1
‑
10g/(L*h)，按重量计所述酪氨酸和碳源的添加速率比为0.5
‑
3；优选地，IPTG添加终浓度为0.4
‑
0.6mM，碳源为葡萄糖；优选地，所述酪氨酸添加总量为25
‑
30g/L，酪氨酸添加速率为3
‑
5g/(L*h)，按重量计所述酪氨酸和葡萄糖的添加速率比为1
‑
1.2。5.根据权利要求4所述的利用大肠杆菌重组菌生产3,4
‑
二羟基苯乙醇的方法，其特征在于，所述发酵过程中发酵液温度为25
‑
32℃、pH为5.5
‑
7.5，添加IPTG时发酵液中菌体OD
600nm
≥10。6.根据权利要求5所述的利用大肠杆菌重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ七四专利代理机构，
申请(专利权)人：杭州唯铂莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：