一种利用克雷森缩合反应生产庚二酸的全生物合成法制造技术

本发明专利技术公开了一种利用克雷森缩合反应生产庚二酸的全生物合成法，属于生物工程领域。本发明专利技术以敲除了8

【技术实现步骤摘要】
一种利用克雷森缩合反应生产庚二酸的全生物合成法


[0001]本专利技术涉及一种利用克雷森缩合反应生产庚二酸的全生物合成法，属于生物工程领域。

技术介绍

[0002]庚二酸(Pimelic acid,Heptanedioic acid)是一种中长链二羧酸(七碳)。庚二酸在工业生产中的应用极为广泛，是制造二酯、聚酯和聚酰胺等的重要中间体，是合成润滑油、增塑剂、导热油、介电流体、燃料添加剂、漂白剂等的原料。同时，庚二酸还是合成生物素(辅酶R、维他命H)，一种重要的微量元素的前体物质。
[0003]目前庚二酸的化学合成方法主要包括氧化还酮法(利用硝酸氧化环庚酮)、利用丁二烯和丙稀晴合成、戊醇还原、利用钠裂解水杨酸制取等。但这些方法普遍具有工艺繁多、反应时间长、对环境负担重等缺点。近年来，随着代谢工程、合成生物学等领域的迅猛发展和社会对环境保护意识的增强，利用全生物法合成庚二酸收到了广泛的关注。
[0004]利用全生物合成庚二酸的方法目前主要有两种：第一种方法是通过过表达枯草芽孢杆菌中的BioI
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orf2
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orf3基因实现庚二酸的合成(Zhang,W.
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W.,Yang,M.
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M.,Li,H.
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x.,and Wang,D.(2011)Construction of recombinant Bacillus subtilis strains for efficient pimelic acid synthesis.Electronic Journal of Biotechnology.14,1
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1.)，但合成机理尚不明确；第二种方法是利用结合逆β
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氧化的非脱羧型克雷森缩合反应，以戊二酰辅酶A和菌体内部产生的乙酰辅酶A作为前体物质，利用cat1、paaJ、paaH、paaF、tdTER基因合成庚二酸(Cheong,S.,Clomburg,J.M.,and Gonzalez,R.(2016)Energy
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and carbon
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efficient synthesis of functionalized small molecules in bacteria using non
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decarboxylative Claisen condensation reactions.Nature Biotechnology.34,556
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561.)。这两种方法虽然都成功合成了庚二酸，但其产量、产率和生产强度远未达到工业生产标准。在结合逆β
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氧化的非脱羧型克雷森缩合反应中，PaaJ蛋白(Ⅱ型硫解酶)通过缩合庚二酰辅酶A和乙酰辅酶A生成3
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酮基庚二酰ACP，构成七碳化合物骨架，再经后续的反应生成庚二酸。PaaJ蛋白来自大肠杆菌内源的苯乙酸降解途径，催化将乙酰辅酶A和丁二酰辅酶A缩合生成为3
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酮基己二酰辅酶A的反应，并且已经有实验证明该蛋白对其他类型的底物的催化效果不好，有较强的底物特异性。因此，若是能找到一种能够特异性催化形成七碳化合物反应的酶，势必对庚二酸的生物合成有重大的帮助。

技术实现思路

[0005]在现有的研究中，报道了一种存在于根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的BioZ蛋白，一种Ⅲ型3
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酮基ACP合成酶，可以特异性催化将戊二酰辅酶A和丙二酰ACP缩合生成3
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酮基庚二酰ACP的反应。因此，针对目前存在的问题，本专利技术以该基因为基础，结合逆β
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氧化(部分脂肪酸合成途径基因)，设计了一条合成庚二酸的新代谢途径并且成功合成了庚二酸，分模块过表达了来自根瘤农杆菌的Ⅲ型3
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酮酰ACP合成酶(BioZ)、来自大肠杆菌3
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酮酰ACP还原酶(FabG)、3
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羟酰ACP脱水酶(FabA)、烯酰ACP还原酶(FabI)、乙酰辅酶A硫酯酶(
′
TesA)，并敲除了基因bioF，通过进一步的发酵优化，显著提升了庚二酸的产量，为庚二酸的全生物合成进一步发展提供了新思路。
[0006]本专利技术提供了一种全生物合成庚二酸的方法，所述方法是利用基因工程菌发酵生产庚二酸；所述基因工程菌敲除了编码8
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氨基7
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酮壬酸合成酶的基因bioF，并分模块过表达了来自根瘤农杆菌的Ⅲ型3
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酮基乙酰ACP合成酶(BioZ)、来自大肠杆菌3
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酮基乙酰ACP还原酶(FabG)、3
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羟基乙酰ACP水合酶(FabA)、烯酰ACP还原酶(FabI)、乙酰辅酶A硫酯酶(
′
TesA)
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种生产庚二酸的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌为在大肠杆菌中敲除了编码8
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氨基7
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酮壬酸合成酶的基因bioF、过表达编码3
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酮酰ACP还原酶(FabG)的基因，并表达编码来源于根瘤农杆菌的Ⅲ型3
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酮酰ACP合成酶(BioZ)基因或是表达将所述Ⅲ型3
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酮酰ACP合成酶(BioZ)第115位突变为丝氨酸的编码基因。
[0008]在一种实施方式中，还表达了编码3
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羟酰ACP脱水酶的基因和编码烯酰ACP还原酶的基因，并同时再表达编码乙酰辅酶A硫酯酶的基因。
[0009]在一种实施方式中，利用质粒pRSFDuet
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1表达所述编码Ⅲ型3
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酮酰ACP合成酶的基因、编码3
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酮ACP还原酶的基因、编码3
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羟酰ACP脱水酶的基因和编码烯酰ACP还原酶的基因。
[0010]在一种实施方式中，利用质粒pCDFDuet
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1表达所述编码乙酰辅酶A硫酯酶的基因。
[0011]在一种实施方式中，所述编码8
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氨基7
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酮壬酸合成酶的基因在KEGG中的基因号为ECD_00743。
[0012]在一种实施方式中，所述Ⅲ型3
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酮酰ACP合成酶的NCBI登录号为AAK89424.2；所述3
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酮酰ACP还原酶的NCBI登录号为WP_001008532；所述3
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羟酰ACP脱水酶的NCBI登录号为BBS08210.1；所述烯酰ACP还原酶的NCBI登录号为WP_000506490.1；所述乙酰辅酶A硫酯酶的NCBI登录号为RDQ20295.1。
[0013]在一种实施方式中，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。
[0014]本专利技术的第二个目的是提供一种全细胞转化生产庚二酸的方法，所述方法是利用所述的重组大肠本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产庚二酸的重组大肠杆菌，其特征在于，在大肠杆菌中敲除了编码8
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氨基7
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酮壬酸合成酶的基因、过表达编码3
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酮酰ACP还原酶的基因，并表达编码来源于根瘤农杆菌的Ⅲ型3
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酮酰ACP合成酶基因或是表达将所述Ⅲ型3
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酮酰ACP合成酶第115位突变为丝氨酸的编码基因。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，还表达了3
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羟酰ACP脱水酶的编码基因和烯酰ACP还原酶的编码基因，并同时再表达乙酰辅酶A硫酯酶的编码基因。3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述编码8
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氨基7
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酮壬酸合成酶的基因在KEGG中的基因号为ECD_00743。4.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述Ⅲ型3
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酮酰ACP合成酶的NCBI登录号为AAK89424.2；所述3
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酮酰ACP还原酶的NCBI登录号为WP_001008532；所述3
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羟酰ACP脱水酶的NCBI登录号为BBS08210.1；所述烯酰ACP还原酶的NCBI登录号为WP_000506490.1；所述乙酰辅酶A硫酯酶的NCBI登录号为RDQ20295.1。5.一种全细胞转化生产庚二酸的方法，其特征在于，利用权利要求1～4任一所述的重组大肠杆菌发酵生产庚二酸。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将权利要求1～4任一所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓禹，李国辉，支睿，鲍青青，李顺，毛银，周胜虎，赵运英，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：