一种根瘤菌HH103的多基因突变体及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种根瘤菌HH103的多基因突变体及应用，属于农用微生物技术领域。为了在降低人工成本的前提下，减少根瘤的数量，解决了很难控制大豆根瘤数量的技术问题。本发明专利技术提供了一种根瘤菌HH103的多基因突变体，其特征在于，所述多基因突变体是以根瘤菌为出发菌，将出发菌株中的NopT基因、NopC基因和NopL基因中的任意两个或三个基因进行突变或者沉默获得的。经过数次实验和不同群体的验证表明NopT基因、NopC基因和NopL基因中的任意两个或三个基因进行突变获得的突变体能减少大豆的根瘤的数量，为后续研究大豆

【技术实现步骤摘要】
一种根瘤菌HH103的多基因突变体及应用


[0001]本专利技术属于农用微生物领域，具体涉及一种根瘤菌HH103的多基因突变体及应用。

技术介绍

[0002]氮元素是限制作物生长的最主要元素之一，但是土壤中能够被植物所利用的氮元素非常有限，主要还是由化学肥料来提供。然而，随着氮肥使用量的不断增加，这不仅抑制根瘤菌与豆科植物间的共生固氮作用，而且给生态环境带来了诸多不利的影响。所以，在无化学肥料供应的情况下，共生固氮可以为豆科植物的生长发育提供足够的氮源。在大豆根系被根瘤菌侵染后会形成共生根瘤，根瘤会通过生物固氮的的方式将空气中的氮气转化成氨为大豆提供氮源。增加大豆与根瘤菌间的固氮能力，既可以大幅度减少氮肥的使用，同时也可以提高大豆产量。因此，提高豆科植物自身的固氮能力对生态环境与农业发展具有重要意义。
[0003]豆科植物与根瘤菌的共生结瘤过程中有很多信号分子的传导参与，其中根瘤菌的Ⅲ型泌出系统分泌的Ⅲ型效应因子是最主要的信号分子之一，它影响着根瘤菌与宿主植物之间共生关系的建立。但是Ⅲ型效应因子是如何影响植物结瘤的分子机制还不清楚，以及根瘤菌与豆科植物间的互作基因还没有深入的研究。
[0004]大豆根瘤的数目是影响大豆共生固氮和生长情况的重要的因素，目前控制大豆根瘤菌的数量是没有办法通过人为来控制的，只能通过不断的更换根瘤菌摸索适合于接种大豆的根瘤菌维持稳定的根瘤数量，操作很麻烦并且工程量很大，未知的因素也比较多。现在急需一种可以控制大豆根瘤数量的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了在降低人工人本的前提下，减少根瘤的数量，解决了很难控制大豆根瘤数量的技术问题。
[0006]本专利技术提供一种根瘤菌(Sinorhizobium fredii)HH103的多基因突变体，所述多基因突变体是以根瘤菌为出发菌，将出发菌株中的NopT基因、NopC基因和NopL基因中的任意两个或三个基因进行突变或者沉默获得的。
[0007]进一步地限定，所述NopT基因的序列如SEQ ID NO.15所示；所述NopC基因的序列如SEQ ID NO.16所示；所述NopL基因的序列如SEQ ID NO.17所示。。
[0008]进一步地限定，任意两个基因进行突变或沉默获得的突变体的方法：将NopT基因和NopC基因与pJQ200SK载体连接得到重组载体，然后将重组载体导入到根瘤菌HH103中得到根瘤菌HH103的多基因突变体。
[0009]进一步地限定，任意两个基因进行突变或沉默获得的突变体的方法：将NopL基因和NopC基因与pJQ200SK载体连接得到重组载体，然后将重组载体导入到根瘤菌HH103中得到根瘤菌HH103的基多因突变体。
[0010]进一步地限定，任意两个基因进行突变或沉默获得的突变体的方法：将NopL基因
和NopT基因与pJQ200SK载体连接得到重组载体，然后将重组载体导入到根瘤菌HH103中得到根瘤菌HH103的多基因突变体。
[0011]进一步地限定，三个基因进行突变或者沉默获得突变体的方法：将NopL基因、NopC基因和NopT基因与pJQ200SK载体连接得到重组载体，然后将重组载体导入到根瘤菌HH103中得到根瘤菌HH103的多基因突变体。
[0012]本专利技术提供一种减少大豆根瘤数目的试剂，所述试剂的有效成分是上述的根瘤菌HH103的多基因突变体。
[0013]本专利技术提供上述试剂在减少大豆根瘤数目中的应用，将上述的试剂接种野生型大豆幼苗；所述大豆品种为Charleston、东农594、绥农14、ZYD00006、Nattosan、合00
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23、红丰11、绥02
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339、紫花2号、黑农44、黑农35或北丰11。
[0014]9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，在大豆幼苗生长至对生真叶期，对大豆苗施用含上述的多基因突变体的菌液，接菌数量为大于2
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105个/株，培育接种菌液后的大豆30
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40天。
[0015]本专利技术提供上述的多基因突变体在大豆育种中的应用。
[0016]有益效果：结瘤鉴定结果显示，两个单突变体HH103ΩNopT、HH103ΩNopC在的结瘤数目均有不同程度的减少，其中HH103ΩNopC与野生型HH103相比减少结果最为显著；单基因突变体HH103ΩNopL结瘤数目略有增加，但其显著性最小，说明NopL在CSSL亲本绥农14中对共生结瘤的影响很小；双基因突变体HH103ΩNopLΩNopC、HH103ΩNopLΩNopT结瘤数目显著性减少，但是与单基因突变体HH103ΩNopT、HH103ΩNopC相比结瘤数目略有上调；三基因突变体HH103ΩNopTΩNopCΩNopL结瘤数目同样减少，而且其减少结果最为显著。为了减少单一大豆品种对结果产生的片面性，将双基因突变体与三基因突变体接种30份种植资源，除了个别品种以外，其他结果均与绥农14保持一致。
附图说明
[0017]图1为NopT上、下游片段，Cm片段和NopT
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Cm大片段扩增，其中，M1：Trans 2K Plus DNA marker；M2：Trans 2K PlusⅡDNA marker；1：NopT上游片段(1020bp)；2：NopT下游片段(1000bp)；3：Cm片段(1010bp)；4、5：NopT
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Cm大片段(3030bp)。
[0018]图2为NopT
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Cm
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pJQ200SK菌液PCR结果图，其中，M：Trans 2K Plus DNA marker；1：插入pJQ200SK的NopT
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Cm大片段(3030bp)。
[0019]图3为突变体HH103ΩNopTΩNopCΩNopL的PCR鉴定，其中，M：Trans 2K Plus DNA marker；图A：引物NopT
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S
‑
F
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X、NopT
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A
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R
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X进行第一轮鉴定；图B：引物NopT
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S
‑
F
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X、Cm
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R进行第二轮验证，图C：引物Cm
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F、Cm
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R进行第三轮PCR验证，其中10泳道为HH103ΩNopTΩNopCΩNopL突变体。
[0020]图4为突变体HH103ΩNopTΩNopCΩNopL的Southern鉴定，其中，M:DL 15000DNA Ladder；1:HH103(Xho I)；2:HH103ΩNopTΩNopCΩNopL(Xho I)。
[0021]图5为HH103ΩpFAJ1702
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Flag
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HNopT的PCR鉴定结果图，其中，M：Trans 2K本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种根瘤菌(Sinorhizobium fredii)HH103的多基因突变体，其特征在于，所述多基因突变体是以根瘤菌为出发菌，将出发菌株中的NopT基因、NopC基因和NopL基因中的任意两个或三个基因进行突变或者沉默获得的。2.根据权利要求1所述的多基因突变体，其特征在于，所述NopT基因的序列如SEQ ID NO.15所示；所述NopC基因的序列如SEQ ID NO.16所示；所述NopL基因的序列如SEQ ID NO.17所示。3.根据权利要求1所述的多基因突变体，其特征在于，任意两个基因进行突变或沉默获得的突变体的方法：将NopT基因和NopC基因与pJQ200SK载体连接得到重组载体，然后将重组载体导入到根瘤菌HH103中得到根瘤菌HH103的多基因突变体。4.根据权利要求1所述的多基因突变体，其特征在于，任意两个基因进行突变或沉默获得的突变体的方法：将NopL基因和NopC基因与pJQ200SK载体连接得到重组载体，然后将重组载体导入到根瘤菌HH103中得到根瘤菌HH103的基多因突变体。5.根据权利要求1所述的多基因突变体，其特征在于，任意两个基因进行突变或沉默获得的突变体的方法：将NopL基因和NopT基因与pJQ200SK载体连接得到重组载体，然后将重组载体导入到根瘤菌HH103中得到根瘤菌HH103...

【专利技术属性】
技术研发人员：辛大伟，陈庆山，刘春燕，齐照明，胡振帮，杨明亮，邹佳男，赵莹，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：