鱼源无乳链球菌internalin基因LRR结构域敲除突变株及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种鱼源无乳链球菌internalin基因LRR结构域敲除突变株及其制备方法和应用，其中的突变株(Streptococcusagalactiae)TOS01ΔLRR于2022年6月13日保存于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，其保藏编号为GDMCC No：62538。申请人采用本发明专利技术所述的突变株进行动物和细胞实验研究其对无乳链球菌毒力的影响，结果显示其对实验动物的组织载菌量和对细胞的黏附和侵入率显著降低，可用于制备鱼类无乳链球菌疫苗。可用于制备鱼类无乳链球菌疫苗。可用于制备鱼类无乳链球菌疫苗。

【技术实现步骤摘要】
鱼源无乳链球菌internalin基因LRR结构域敲除突变株及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及鱼源无乳链球菌internalin基因LRR结构域敲除突变株及其制备方法和应用，属于基因工程


技术介绍

[0002]无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)属于B组链球菌(Group B streptococci)，是一种革兰氏阳性、链状球菌，拥有广泛的宿主范围。对哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼类均有致病作用，可导致新生儿肺炎和人类脑膜炎、奶牛乳腺炎、鱼类脑膜炎和败血症，给人类健康带来威胁，也给家畜和水产养殖业造成严重的经济损失。近年来，世界范围的鱼类养殖区，特别是罗非鱼养殖区频繁发生大规模无乳链球菌感染事件，死亡率高达30～80％，给罗非鱼的养殖生产造成了毁灭性打击，也让罗非鱼一直以来具有的抗病力强、不易患病等观点遭到了强烈质疑。因此，开展对鱼源无乳链球菌致病机理的研究，对于了解无乳链球菌对罗非鱼的致病性具有重要的意义。
[0003]之前无乳链球菌被归属为非胞内寄生菌，但近年来多篇报道显示其可在罗非鱼多种细胞内存活，包括肠上皮细胞、红细胞和吞噬细胞，为链球菌病的预防和治疗提出了挑战，这也是生产上使用抗生素以及传统灭活疫苗防治链球菌病效果差、易反复的原因之一。基因缺失减毒活疫苗，是指通过基因工程技术，将病毒的致病基因缺失掉而制成的一种新型疫苗。与传统疫苗相比具有重复递呈抗原和持续刺激免疫应答的优势，因而通过缺失毒力相关因子构建减毒疫苗已成为胞内细菌疫苗研究的热点。
>[0004]基因敲除技术的应用是在DNA同源重组原理发展起来的，该技术的基本原理是通过克隆目的基因上下游同源片段构建到特定载体上，与基因组发生同源交换，将目标基因置换下来，以实现缺失目的基因的目标。目前，虽然基因敲除技术已经广泛的应用于原核生物中，但不同的菌株所采用的方法却不尽相同，这其中还涉及到效率问题，包括成功的效率和时间的效率。无乳链球菌为革兰氏阳性菌，具有细胞壁厚，质粒难以转染，同源交换效率低等问题。如何建立一套高效、快速的基因敲除系统已成为研究热点的问题。
[0005]内化素(internalin)是一种定位在无乳链球菌表面、通过N端半胱氨酸连接在细菌表面的脂蛋白。经生物信息学分析发现，无乳链球菌internalin C端包含一个串联排列的富含亮氨酸的重复区(Leucine
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rich repeats，LRRs)。研究显示，LRR结构域的蛋白可参与蛋白与蛋白之间的相互作用，涉及不同配体的识别并在细胞黏附过程中发挥重要作用。例如李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)至少有25个含LRR结构域的内化素家族蛋白与细菌对宿主细胞的粘附和侵袭相关。其中，internalin A蛋白可与人类肠上皮E
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钙粘蛋白(E
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cadherin)共价结合而促进细菌侵入人肠上皮细胞跨越肠障碍。目前为止，internalin基因在无乳链球菌中所发挥的生物学功能尚不清楚。
[0006]鉴于上述原因，为明确internalin基因LRR结构域在无乳链球菌中的生物学功能，本申请采用同源重组系统，利用pSET4s质粒作为自杀质粒载体构建鱼源无乳链球菌TOS01
的internalin基因LRR结构域缺失株，研究其对动物和细胞实验研究其对无乳链球菌毒力的影响，为鱼类无乳链球菌病的防治和减毒活疫苗研制奠定基础。

技术实现思路

[0007]本专利技术要解决的技术问题是提供一种新的鱼源无乳链球菌internalin基因LRR结构域敲除突变株及其制备方法和应用。
[0008]本专利技术所涉及的突变株(Streptococcus agalactiae)TOS01ΔLRR，已于2022年6月13日保存于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所)，其保藏编号为GDMCC No：62538。
[0009]本专利技术所述的鱼源无乳链球菌internalin基因LRR结构域敲除突变株(Streptococcus agalactiae)TOS01ΔLRR(在本申请中也简称为敲除突变株TOS01ΔLRR或突变株TOS01ΔLRR或突变株或TOS01ΔLRR)，它是将无乳链球菌野生株TOS01(在本申请中也简称为野生株TOS01或野生菌TOS01或野生株或野生菌或TOS01)中internalin基因从第1648位至2409位的编码LRR结构域基因序列用红霉素抗性基因所代替而获得；其中，
[0010]所述无乳链球菌野生株TOS01从感染无乳链球菌的卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)中分离得到；
[0011]所述无乳链球菌野生株TOS01中internalin基因从第1648位至2409位的编码LRR结构域基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0012]所述红霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013]本申请中涉及的无乳链球菌野生株TOS01采用现有常规方法从感染无乳链球菌的卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)中分离得到。
[0014]本专利技术所述的鱼源无乳链球菌internalin基因LRR结构域敲除突变株(Streptococcus agalactiae)TOS01ΔLRR的生长曲线与无乳链球菌野生株TOS01相似，多以2至3个短链状存在，与无乳链球菌野生株TOS01相比，链条变短，荚膜多糖显著增厚，对大黄鱼肾细胞的侵入和粘附能力较野生株均呈下降趋势。
[0015]本专利技术所述鱼源无乳链球菌internalin基因LRR结构域敲除突变株(Streptococcus agalactiae)TOS01ΔLRR是利用同源重组基因敲除技术将分离于感染无乳链球菌的卵形鲳鲹分离得到的无乳链球菌野生株TOS01染色体上编码internalin蛋白的internalin基因LRR保守结构域进行敲除，经壮观霉素和红霉素双抗性平板筛选和PCR验证，再结合多重PCR鉴定，确定所获得的菌株为基因敲除突变株，命名为TOS01ΔLRR。因此，本专利技术所述鱼源无乳链球菌internalin基因LRR结构域敲除突变株TOS01ΔLRR的制备方法包括：构建含有目的基因(即LRR结构域)的上游同源臂和下游同源臂，以及红霉素抗性基因序列的重组质粒pSET4s
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LRR，将其电转化至无乳链球菌野生株TOS01中，通过调节不同温度丢失穿梭质粒pSET4s，之后采用红霉素抗性和壮观霉素双重抗性平板筛选和PCR验证，再经多重PCR鉴定，得到鱼源无乳链球菌internalin基因LRR结构域敲除突变株(Streptococcus agalactiae)TOS01ΔLRR；其中，在电转化时，电穿孔仪参数为：电压2.5KV，电容25μF，电阻200Ω，电转杯直径2mm。
[0016]进一步，本专利技术所述鱼源无乳链球菌intern本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鱼源无乳链球菌internalin基因LRR结构域敲除突变株(Streptococcus agalactiae)TOS01ΔLRR，其保藏编号为GDMCC No：62538。2.权利要求1所述的鱼源无乳链球菌internalin基因LRR结构域敲除突变株(Streptococcus agalactiae)TOS01ΔLRR，其特征是，该突变株是将无乳链球菌野生株TOS01中internalin基因从第1648位至2409位的编码LRR结构域基因序列用红霉素抗性基因所代替；其中，所述无乳链球菌野生株TOS01从感染无乳链球菌的卵形鲳鲹中分离得到；所述无乳链球菌野生株TOS01中internalin基因从第1648位至2409位的编码LRR结构域基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述红霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求1所述的鱼源无乳链球菌internalin基因LRR结构域敲除突变株(Streptococcus agalactiae)TOS01ΔLRR，其特征是，该突变株多以2至3个短链状存在，与无乳链球菌野生株TOS01相比，链条变短，荚膜多糖增厚。4.权利要求1所述鱼源无乳链球菌internalin基因LRR结构域敲除突变株(Streptococcus agalactiae)TOS01ΔLRR的制备方法，其特征是，构建含有目的基因的上游同源臂和下游同源臂，以及红霉素抗性基因序列的重组质粒pSET4s
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LRR，将其电转化至无乳链球菌野生株TOS01中，通过调节不同温度丢失穿梭质粒pSET4s，之后采用红霉素抗性和壮观霉素双重抗性平板筛选和PCR验证，再经多重PCR鉴定，得到鱼源无乳链球菌internalin基因LRR结构域敲除突变株(Streptococcus agalactiae)TOS01ΔLRR；其中，在电转化时，电穿孔仪参数为：电压2.5KV，电容25μF，电阻200Ω，电转杯直径2mm。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是，包括以下步骤：1)以无乳链球菌野生株TOS01基因组DNA为模板，扩增internalin基因LRR结构域上、下游同源臂，分别得到目的基因的上游同源臂和下游同源臂基因序列；以pAT18质粒为模板，扩增红霉素抗性基因，得到红霉素抗性基因序列；2)将步骤1)得到的序列按上游同源臂基因序列、红霉素抗性基因序列、下游同源臂基因序列的顺序，利用双酶切连接方法依次连接到阳性菌穿梭质粒pSET4s载体上，构建得到重组质粒pSET4s
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LRR；3)将测序正确的重组质粒pSET4s
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LRR电转化至无乳链球菌野生株TOS01中，通过25～28℃低温同源重组到37～40℃高温丢失穿梭质粒pSET4s，采用红霉素抗性和壮观霉素双重抗性平板筛选和PCR验证，再经多重PCR鉴定，得到鱼源无乳链球菌i...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡小辉，
申请(专利权)人：权利要求书二页说明书九页序列表五页附图四页，
类型：发明
国别省市：