酿酒酵母产樱花素代谢工程菌株的构建方法及其应用技术

本发明专利技术通过多水平代谢工程策略首次实现了酿酒酵母以葡萄糖为碳源从头合成樱花素，首先在酿酒酵母中成功构建一条从葡萄糖开始生产樱花素的完整合成路径，接着强化樱花素前体对香豆酸、丙二酰辅酶A的供应来提供产率。本发明专利技术获得的代谢工程菌株发酵樱花素，是迄今报道的微生物法产樱花素的最高水平。的微生物法产樱花素的最高水平。的微生物法产樱花素的最高水平。

【技术实现步骤摘要】
酿酒酵母产樱花素代谢工程菌株的构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及到一种产樱花素的酿酒酵母代谢工程菌株构建及应用。

技术介绍

[0002]樱花素(Sakuranetin)，又称樱花亭，化学名为5，7
‑
二羟基
‑
4＇
‑
苄氧基黄烷酮，最初是从樱花树皮中分离的二氢黄酮类化合物，是一种植物的植保素。目前研究发现，樱花素具有抗炎活性，抗肿瘤和免疫调节作用，对哮喘有治疗作用，具有广泛的医药应用潜力。同时，因其具有较高的抗氧化活性，能有效对抗黑色素沉积，改善肤色暗沉，起到美白嫩肤的作用，在化妆品市场上备受青睐，其市场规模不断扩大。
[0003]目前，植物提取法是生产樱花素的主要方法，尽管有许多植物能够生产樱花素，但这些植物大多数能够提取的樱花素的含量并不高，并且由于提取樱花素的成本及技术受到限制，大量生产樱花素，仍面临较多困难。利用合成生物学构建微生物细胞工厂生产樱花素，能够克服上游原料供应、季节、场地的限制，实现绿色生物制造是最有前景的生产方向。迄今，在酵母中合成樱花素未有报道，本专利技术构建的产樱花素的酵母工程菌具有很好的推广应用前景。

技术实现思路

[0004]基于目前各种方法的缺陷，本专利技术的目的是构建多酶共表达的酿酒酵母代谢工程菌，并将其应用于樱花素的生产，首次实现樱花素在酿酒酵母体内的生产。
[0005]本专利技术采用的技术方案是这样的：
[0006]酿酒酵母产樱花素工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
[0007]1)菌株和质粒：大肠杆菌DH5α用于所有质粒的构建和繁殖；以酿酒酵母CEN.PK2
‑
1C作为出发菌株；
[0008]2)相关基因的获取：所有天然启动子、基因和终止子均通过使用酿酒酵母CEN.PK2
‑
1C基因组DNA或可用质粒作为模板进行PCR扩增；对于密码子优化的异源基因，使用合成片段或可用质粒进行PCR扩增；来自拟南芥的At4CL1通过使用拟南芥cDNA作为模板进行扩增；密码子优化的三个基因AtPAL2、AtC4H和AtATR2均来自拟南芥，从质粒pCfB2584和pCfB2767获得，CoNOMT通过使用水稻eDNA作为模板进行扩增；两个表达盒包括来自酿酒酵母的CYB5和密码子优化的来自拟南芥的At4CL2分别从pCfB2767和pCfB2584直接扩增；；EcaroL扩增来自大肠杆菌基因组DNA，并分别从相应的克隆载体pCHS和pCHI扩增了密码子优化的两个基因CHS、和CHI，然后，将这些候选基因、启动子或终止子克隆到辅助质粒pH1、pH2、pH3、pH4、pH5、pH6或pUC19使用限制性连接或Gibson组装获得基因表达盒质粒；
[0009]3)菌株构建，包括以下子步骤：
[0010]3.1)菌株构建使用的方法：
[0011]采用CRISPR/Cas9系统，使用Cas9和gRNA表达质粒在酿酒酵母菌株中进行基因缺
失和DNA片段位点特异性整合；为了促进基因操作，从p42H
‑
spCas9扩增了Cas9表达盒，并将其整合到酿酒酵母CEN.PK2
‑
1C中的IX
‑
1基因组位点，由此产生的菌株C00：CEN.PK2
‑
1C，IX1：：TEFp
‑
SpCas9
‑
ADH2t被用作DNA整合和生物合成途径工程的宿主；然后使用LiAc/ssDNA/PEG酵母转化法将等摩尔量的纯化线性化片段与相应的gRNA质粒共转化到S.cerevisiae，并在补充有200μg/LG418的YPD平板上选择转化子；使用Green Taq Mix通过菌落PCR验证克隆；随后，这些具有正确模块整合的克隆在YPD液体培养基中培养过夜，然后在不含抗生素的平板上划线以环出gRNA载体；
[0012]3.2)葡萄糖从头合成樱花素途径的构建：
[0013]在C00菌株基础上通过引入苯丙氨酸裂解酶AtPAL2、肉桂酸羟化酶AtC4H构建了酿酒酵母中从苯丙氨酸到香豆酸CIA的路径，标记菌株C01；后继分别引入P450还原酶AtATR2，并过表达酿酒酵母酵母天然细胞色素CYB5，构建香豆酸CIA到对香豆酸p
‑
HCA的生物合成途径，获得菌株C02；在C02菌株基础上继续引入酪氨酸解氨酶TAL，4
‑
香豆酸
‑
CoA连接酶4CL，查耳酮合成酶CHS，查耳酮异构酶CHI，柚皮素
‑7‑
O
‑
甲基转移酶NOMT，构建一条从葡萄糖开始从头生产樱花素的完整合成路径，获得产樱花素初始菌株YHS02；
[0014]3.3)调整樱花素合成基因的拷贝数强化樱花素生物合成：
[0015]在YHS02菌株基础上多拷贝樱花素合成途径中的苯丙氨酸解氨酶基因PAL、酪氨酸解氨酶TAL、查耳酮合成酶CHS和柚皮素
‑7‑
O
‑
甲基转移酶NOMT，得到菌株YHS07；
[0016]3.4)通过移除芳香族氨基酸合成路径中的限速因子来强化樱花素前体对香豆酸的供应：
[0017]在YHS07菌株基础上选择过表达两个不受芳香族氨基酸抑制的DAHP合酶突变体ARO3
K222L
、ARO4
K229L
和分支酸变位酶突变体ARO7
G141S
来增强酪氨酸和苯丙氨酸的合成，得到的工程菌YHS09；
[0018]3.5)优化L
‑
苯丙氨酸分支并增强樱花素合成的代谢流：
[0019]通过在YHS09菌株基础上敲除酪氨酸和苯丙氨酸合成途径过程中的旁路基因pdc5和aro10来增强樱花素合成的代谢流，得到菌株YHS11；接着，在YHS11工程菌基础上系统地过表达了来自大肠杆菌的异源莽草酸激酶EcaroL、内源性苯酚酸脱水酶PHA2、分支酸合酶ARO2和五功能芳香蛋白ARO1构建成功的菌株YHS16：
[0020]3.6)增强樱花素前体丙二酰辅酶A的含量：
[0021]优化莽草酸途径前体供应提高CGA产量：在YHS16菌株基础上，通过敲除YPL062W同时插入乙酰辅酶A羧化酶ACC1突变体ACC1
S659A，S1157A
来强化了樱花素另一前体丙二酰辅酶A的合成，得到工程菌株YHS18。
[0022]本专利技术还采用了这样的技术方案：前述的工程菌株YHS18在樱花素生产中的应用，采用摇瓶发酵法或生物反应器发酵法。
[0023]本专利技术通过多水平代谢工程策略首次实现了酿酒酵母以葡萄糖为碳源从头合成樱花素。首先在酿酒酵母(Saccharomyce scerevisiae)中成功构建一条从葡萄糖开始生产樱花素的完整合成路径(PAL、TAL、C4H、ATR2、4CL
‑
1、CHS、CHI和NOMT)构建好的代谢工程本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.酿酒酵母产樱花素工程菌株的构建方法，包括如下步骤：1)菌株和质粒：大肠杆菌DH5α用于所有质粒的构建和繁殖；以酿酒酵母CEN.PK2
‑
1C作为出发菌株；2)相关基因的获取：所有天然启动子、基因和终止子均通过使用酿酒酵母CEN.PK2
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1C基因组DNA或可用质粒作为模板进行PCR扩增；对于密码子优化的异源基因，使用合成片段或可用质粒进行PCR扩增；来自拟南芥的At4CL1通过使用拟南芥cDNA作为模板进行扩增；密码子优化的三个基因AtPAL2、AtC4H和AtATR2均来自拟南芥，从质粒pCfB2584和pCfB2767获得，CoNOMT通过使用水稻cDNA作为模板进行扩增；两个表达盒包括来自酿酒酵母的CYB5和密码子优化的来自拟南芥的At4CL2分别从pCfB2767和pCfB2584直接扩增；；EcaroL扩增来自大肠杆菌基因组DNA，并分别从相应的克隆载体pCHS和pCHI扩增了密码子优化的两个基因CHS、和CHI，然后，将这些候选基因、启动子或终止子克隆到辅助质粒pH1、pH2、pH3、pH4、pH5、pH6或pUC19使用限制性连接或Gibson组装获得基因表达盒质粒；3)菌株构建，包括以下子步骤：3.1)菌株构建使用的方法:采用CRISPR/Cas9系统，使用Cas9和gRNA表达质粒在酿酒酵母菌株中进行基因缺失和DNA片段位点特异性整合；为了促进基因操作，从p42H
‑
spCas9扩增了Cas9表达盒，并将其整合到酿酒酵母CEN.PK2
‑
1C中的IX
‑
1基因组位点，由此产生的菌株C00：CEN.PK2
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1C，IX1::TEFp
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SpCas9
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ADH2t被用作DNA整合和生物合成途径工程的宿主；然后使用LiAc/ssDNA/PEG酵母转化法将等摩尔量的纯化线性化片段与相应的gRNA质粒共转化到S.cerevisiae，并在补充有200μg/LG418的YPD平板上选择转化子；使用Green Taq Mix通过菌落PCR验证克隆；随后，这些具有正确模块整合的克隆在YPD液体培养基中培养过夜，然后在不含抗生素的平板上划线以环出gRNA载体；3.2)葡萄糖从头合成樱花素途径的构建：在C00菌株基础上通过引...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟卫鸿，何炎，涂帅，肖锋，范文佳，侯正雨，黄子炎，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：