一种RosR突变体及其重组微生物与应用制造技术

本发明专利技术涉及微生物工程技术领域，具体公开了一种RosR突变体及其重组微生物与应用。本发明专利技术的RosR突变体，其以野生型RosR的氨基酸序列为参考序列，所述RosR突变体含有第34位缬氨酸被取代的突变；所述野生型RosR的氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示。本发明专利技术通过对rosR基因进行修饰，使得含有该突变体的菌株产生L

【技术实现步骤摘要】
一种RosR突变体及其重组微生物与应用


[0001]本专利技术涉及微生物工程
，具体地说，涉及一种RosR突变体及其重组微生物与应用。

技术介绍

[0002]谷氨酰胺是一种非必需氨基酸。化学名称为2
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氨基
‑4‑
氨甲酰基丁酸。谷氨酰胺是蛋白质合成中的编码氨基酸，可促进蛋白质的合成，抑制蛋白质的分解，可用于治疗胃及十二指肠溃疡，在医药行业中有重要作用。
[0003]目前，谷氨酰胺最常用的生产方法为发酵法，主要以谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)为生产菌发酵生产谷氨酰胺。谷氨酸棒状杆菌是异养需氧型，为革兰氏阳性菌，具有生长速度快、非致病、对自身代谢物弱降解能力的特性。发酵法具有原料来源广泛、生产成本低、产品质量可控、产物单一等优点。谷氨酸棒杆菌自身的谷氨酰胺合酶编码基因会被阻遏蛋白或者转录调控因子抑制，导致转录水平降低，酶活急剧降低，造成底物谷氨酸不能充分利用。其中RosR(Cg1324)是过氧化氢敏感MarR型转录调控因子(2010，Michael Bott，a Hydrogen Peroxide
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sensitive MarR
‑
typeTranscriptional Regulator of Corynebacteriumglutamicum)，RosR可以结合到谷氨酰胺合酶编码基因glnA的启动子区，抑制glnA转录，失活rosR促进谷氨酰胺的积累(2022，Xiangfei Li，MarRr/>‑
type transcription factor RosR regulates glutamate metabolism network and promotes accumulation of L
‑
glutamate in CorynebacteriumglutamicumG01)。因此解除或减弱谷氨酰胺合酶的抑制，促进谷氨酸转化为谷氨酰胺具有重要意义，有必要对其进一步研究，以获得更好的发酵效果。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种可提高L
‑
谷氨酰胺产量的新方法。
[0005]本专利技术的技术方案如下：
[0006]一种RosR突变体，其以野生型RosR的氨基酸序列为参考序列，所述RosR突变体含有第34位缬氨酸被取代的突变；所述野生型RosR的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
[0007]具体地，所述RosR突变体含有第34位缬氨酸被丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、色氨酸或亮氨酸取代的突变。
[0008]优选，所述RosR突变体含有第34位缬氨酸被色氨酸取代的突变。
[0009]本专利技术提供了一种谷氨酸棒杆菌，其细胞内过氧化氢敏感MarR型转录调控因子RosR的第34位氨基酸由缬氨酸(V)突变为丙氨酸(A)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、色氨酸(W)或亮氨酸(L)。
[0010]本专利技术意外发现，通过对谷氨酸棒杆菌的rosR基因进行特定修饰，可使得所述菌株产生L
‑
谷氨酰胺的能力增强，且效果优于现有文献已报道的ΔrosR菌株。
[0011]本专利技术还提供一种DNA分子，其以SEQ ID NO.10为参考序列，所述DNA分子含有第
500
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502位碱基由SEQ ID NO.10中的GTG突变为GCG、GAG、GGG、TGG或CTG的突变。
[0012]本专利技术上述DNA分子中的各突变分别可对应获得RosR的第34位氨基酸由缬氨酸(V)突变为丙氨酸(A)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、色氨酸(W)或亮氨酸(L)的RosR突变体。
[0013]本专利技术另提供一种重组微生物，所述重组微生物表达上述RosR突变体。
[0014]优选，所述重组微生物的出发菌株为谷氨酸棒杆菌。
[0015]本专利技术另提供一种上述重组微生物的如下任一种应用：
[0016](1)在发酵生产L
‑
谷氨酰胺及其衍生物中的应用；
[0017](2)在用于生产L
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谷氨酰胺及其衍生物的微生物遗传育种中的应用；
[0018](3)在提高发酵生产L
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谷氨酰胺及其衍生物产量上的应用。
[0019]本专利技术还提供一种L
‑
谷氨酰胺的生产方法，其包括以重组微生物进行发酵培养的步骤，所述重组微生物如上所述。
[0020]本专利技术的有益效果至少在于：
[0021]本专利技术的通过实验证实，突变菌株MHZ
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0513
‑3‑
rosR
V34A
与出发菌株MHZ
‑
0513
‑
3相比，谷氨酰胺产量由28.9g/L提高到32.8g/L，产酸提高13.5％，副产物谷氨酸、丙氨酸减少，菌株MHZ
‑
0513
‑3‑
ΔrosR摇瓶发酵谷氨酰胺产量从28.9g/L提高到30.2g/L，产酸提高4.5％，由此可见，RosR点突变V34A利于谷氨酰胺的积累，效果优于ΔrosR。当RosR第34位氨基酸由缬氨酸(V)突变为谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、色氨酸(W)、亮氨酸(L)后，谷氨酰胺产量均有提升，副产物谷氨酸和丙氨酸减少，且优于ΔrosR，其中突变为色氨酸(W)后，谷氨酰胺产量提高到34.6g/L，产酸提高19.7％。显而易见，该位点突变成其他氨基酸后也利于谷氨酰胺及其衍生物的生产。
[0022]本专利技术提供了一种新的更有效地提升谷氨酰胺产量的生物发酵方法。
具体实施方式
[0023]下面将结合实施例对本专利技术的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本专利技术的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本专利技术的宗旨和精神的情况下，可以对本专利技术进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
[0024]本专利技术实施例中涉及的引物名称及序列如表1所示。
[0025]表1引物序列(SEQ ID No.1
‑
9)
[0026]引物序列UP
‑
FctagTCTAGACAACAATGGAGTCGGTGTACTUP
‑
RTCAGGTTGTGGTTTTCCGCGAGGGTCTCATCTAGTGTDN
‑
FCGCGGAAAACCACAACCTGADN
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RcccAAGCTTTGGCTGATTGAGTTTTTCTTTCTTC鉴定
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RosR突变体，其特征在于，以野生型RosR的氨基酸序列为参考序列，所述RosR突变体含有第34位缬氨酸被取代的突变；所述野生型RosR的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。2.根据权利要求1所述的RosR突变体，其特征在于，所述RosR突变体含有第34位缬氨酸被丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、色氨酸或亮氨酸取代的突变。3.根据权利要求2所述的RosR突变体，其特征在于，所述RosR突变体含有第34位缬氨酸被色氨酸取代的突变。4.一种DNA分子，其特征在于，以SEQ ID NO.10为参考序列，所述DNA分子含有第500
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502位碱基由SEQ ID NO.10中的GTG突变为GCG、GAG、GGG、TGG或CTG的突变。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：栾明月，姚嘉琪，包明阳，吴涛，赵津津，李岩，
申请(专利权)人：廊坊梅花生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：