钝齿棒杆菌表面蛋白ProH及其在表面展示系统中的应用技术方案

本发明专利技术公开了钝齿棒杆菌表面蛋白ProH及其在表面展示系统中的应用。钝齿棒杆菌表面蛋白ProH的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，通过过表达载体pXMJ19在钝齿棒杆菌中表达量高，可将其用于构建高展示效率的钝齿棒杆菌表面展示系统。是以绿色荧光蛋白的编码基因与钝齿棒杆菌表面蛋白ProH编码基因pgsA融合后表达在细胞中，绿色荧光蛋白通过膜结合蛋白ProH展示在细胞的表面。在细胞的表面。在细胞的表面。

Corynebacterium crenatum surface protein proh and its application in surface display system

【技术实现步骤摘要】
钝齿棒杆菌表面蛋白ProH及其在表面展示系统中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，特别涉及一种钝齿棒杆菌表面蛋白ProH，及其作为锚定蛋白在钝齿棒杆菌表面展示系统中的应用。

技术介绍

[0002]微生物细胞表面展示技术利用分子生物学手段将外源靶蛋白或多肽基因与锚定蛋白基因融合导入宿主中，具体而言，是一种通过特定锚定蛋白将蛋白质或多肽在微生物细胞表面的固定化技术，被展示的靶蛋白可以保持原有的空间构象和生物活性。微生物细胞表面展示在全细胞催化剂、多肽分离、全细胞吸附剂、蛋白文库筛选、疫苗和抗体生产、生物修复、生物传感器等方面都有广阔的应用前景。
[0003]目前在微生物表面展示系统中应用比较多的宿主菌主要有噬菌体、酿酒酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。钝齿棒杆菌是我国科学家从土壤中分离的一种革兰氏阳性菌，广泛应用于氨基酸、有机酸、醇等化合物的生产，属于食品级微生物，具有较低的细胞外蛋白酶活性等优点，具有非常广阔的在微生物细胞表面展应用前景。目前，钝齿棒杆菌的展示系统的研发极少。为增加钝齿棒杆菌细胞表面展示技术的多功能性，开发新的和有效的锚定蛋白非常必要。

技术实现思路

[0004]本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种钝齿棒杆菌表面蛋白ProH。
[0005]本专利技术的另一目的在于提供编码所述钝齿棒杆菌表面蛋白ProH的基因。
[0006]本专利技术的又一目的在于提供一种钝齿棒杆菌细胞表面展示系统。
[0007]本专利技术的再一目的在于提供所述钝齿棒杆菌细胞表面展示系统的构建方法。
[0008]本专利技术的目的通过以下技术方案实现：一种钝齿棒杆菌表面蛋白ProH，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]所述的钝齿棒杆菌蛋白由56个氨基酸组成，大小约为6.02KDa。
[0010]编码所述钝齿棒杆菌表面蛋白ProH的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011]所述的钝齿棒杆菌表面蛋白ProH作为锚定蛋白在钝齿棒杆菌表面展示系统中的应用。
[0012]所述的表面展示系统为钝齿棒杆菌细胞表面展示系统，所述的钝齿棒杆菌表面蛋白ProH可用于构建钝齿棒杆菌细胞表面展示系统，所述的钝齿棒杆菌细胞表面展示系统是以所述钝齿棒杆菌表面蛋白ProH为锚定蛋白将靶蛋白固定在钝齿棒杆菌细胞表面构成的。
[0013]一种钝齿棒杆菌细胞表面展示系统，是以所述的钝齿棒杆菌表面蛋白ProH为锚定蛋白，将靶蛋白固定在钝齿棒杆菌细胞表面构成的。
[0014]所述的靶蛋白为荧光蛋白或任意一种蛋白质。
[0015]所述的钝齿棒杆菌细胞表面展示系统的构建方法，包括如下步骤：
(1)将编码所述钝齿棒杆菌表面蛋白ProH的基因与靶蛋白基因通过搭桥PCR得到融合片段；(2)将步骤(1)中得到的融合基因片段插入表达载体构建表达细胞表面展示蛋白的载体；(3)将步骤(2)构建的载体转化钝齿棒杆菌，然后根据表达载体上的筛选标记筛选阳性转化子，即得到所述钝齿棒杆菌细胞表面展示系统。
[0016]所述的钝齿棒杆菌细胞表面展示系统的构建方法，具体包括如下步骤：(i)将编码所述钝齿棒杆菌表面蛋白ProH的基因、靶蛋白的基因和表达载体通过同源重组的方式，构建得到重组质粒；(ii)将步骤(i)中得到重组质粒转化钝齿棒杆菌，挑取阳性克隆子，得到所述钝齿棒杆菌细胞表面展示系统。
[0017]步骤(i)中所述的编码所述钝齿棒杆菌表面蛋白ProH的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
[0018]步骤(i)中所述的靶蛋白为增强绿色荧光蛋白(sfGFP)或其他靶蛋白。
[0019]所述的增强绿色荧光蛋白(sfGFP)的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0020]步骤(i)中所述的表达载体为规带有氯霉素抗性的谷氨酸棒杆菌/钝齿棒杆菌表达载体；优选为钝齿棒杆菌表达载体pXMJ19。
[0021]本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术提供了一种钝齿棒杆菌表面蛋白ProH，是钝齿棒杆菌的一个跨膜蛋白，经验证，钝齿棒杆菌表面蛋白ProH与增强绿色荧光蛋白的融合蛋白在钝齿棒杆菌表面有非常高的表达量，因此，可将其用于构建高展示效率的钝齿棒杆菌表面展示系统；(2)本专利技术中钝齿棒杆菌表面展示系统是以钝齿棒杆菌表面蛋白ProH为锚定蛋白，将靶蛋白(如荧光蛋白或其他蛋白)固定在钝齿棒杆菌细胞表面构成的，提高了钝齿棒杆菌表面展示系统的内源的锚定蛋白的表达效率。
附图说明
[0022]图1是sfGFP基因、钝齿棒杆菌表面蛋白ProH基因、sfGFP基因和钝齿棒杆菌表面蛋白ProH基因搭桥PCR连接产物。
[0023]图2是含有重组质粒pXMJ19
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ProH
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sfGFP菌株、含有重组质粒pXMJ19
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sfGFP菌株和阴性对照菌株荧光显微镜图。
具体实施方式
[0024]下面结合实施案例对本专利技术进行详细的描述，但本专利技术的实施方法不限于此。除非特别说明，本专利技术涉及的试剂、方法及设备为本
常规试剂、方法及设备。下列实施案例中未注明的具体试验方法及条件，通常按照常规实验方法及条件。除非特别说明，本专利技术所用材料及试剂均可通过市售获得。
[0025]实施案例：钝齿棒杆菌表面展示sfGFP(1) 钝齿棒杆菌表面蛋白ProH基因的克隆根据钝齿棒杆菌表面蛋白ProH基因序列(SEQ ID NO:2)，靶蛋白sfGFP基因以及
pXMJ19上的序列特征，设计扩增引物：P1：5'
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ATTAATTAAGCTTGCATGCCTATGGATCTTTCCGTTCTCAAGGAA
‑
3' (SEQ ID NO:4)；P2：5'
‑
CTCCTTTGCCGCTTCCTTGGCAGCCTCCTTTGCTGCTTCGGAAGAGAGCTTATCCAGGT
‑
3' (SEQ ID NO:5)。
[0026]以钝齿棒杆菌的基因组DNA为模板，以P1和P2为引物，通过PCR方法扩增出钝齿棒杆菌表面蛋白ProH基因序列，扩增条件为：预变性95℃ 5分钟；再进行30个以下循环：95℃变性5秒、62℃退火5秒、72℃延伸5秒；最后72℃延伸10分钟。
[0027](2)靶蛋白sfGFP基因的克隆根据靶蛋白sfGFP基因(SEQ ID NO:3)，钝齿棒杆菌表面蛋白ProH基因序列(SEQ ID NO:2)以及pXMJ19上的序列特征，设计扩增引物：P3：5'
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CCAAGGAAGCGGCAAAGGAGGCGGCCAAGGAGGCAGCAAAGATGCATAAACGAGAAGAA
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3' (SEQ ID NO:6)；P4：5'
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CTGAATTCGAGCTCGGTACCCTTATTATTTGTAGAGCTCATCC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种钝齿棒杆菌表面蛋白ProH，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.编码权利要求1所述的钝齿棒杆菌表面蛋白ProH的基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.根据权利要求1所述的钝齿棒杆菌表面蛋白ProH作为锚定蛋白在表面展示系统中的应用，其特征在于：所述的表面展示系统为钝齿棒杆菌细胞表面展示系统。4.一种钝齿棒杆菌细胞表面展示系统，其特征在于：是以权利要求1所述的钝齿棒杆菌表面蛋白ProH为锚定蛋白，将靶蛋白固定在钝齿棒杆菌细胞表面构成的。5.根据权利要求4所述的钝齿棒杆菌细胞表面展示系统，其特征在于：所述靶蛋白为荧光蛋白。6.根据权利要求4所述所述的钝齿棒杆菌细胞表面展示系统的构建方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将编码权利要求1所述的钝齿棒杆菌表面蛋白ProH的基因与靶蛋白基因通过搭桥PCR得到融合片段；(2)将步骤(1)中得到的融合基因片段插入表达载体构建表达细胞表面展示蛋白的载体；(3)将步骤(2)构...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄明珠，宋卓琳，陈雪岚，涂宗财，李金林，张露，彭斌，胡明明，
申请(专利权)人：江西师范大学，
类型：发明
国别省市：