新蛋白变体及使用其生产L-赖氨酸的方法技术

本公开涉及一种新蛋白变体、包含所述变体的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌株以及使用所述菌株生产L

Novel protein variants and methods for producing L-lysine using them

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】ID NO:3的氨基酸序列的第676位的氨基酸为酪氨酸，并且该变体可包含与由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％或更高的同源性或同一性的氨基酸序列。明显的是，具有缺失、修饰、取代、保守取代或添加了一些序列的氨基酸序列的变体也包括在本公开的范围内，只要该氨基酸序列具有这样的同源性或同一性并表现出对应于本公开的变体功效的功效。
[0014]其实例包括具有在上述氨基酸序列的N末端、C末端和/或氨基酸序列内部的不改变本公开变体功能的序列添加或缺失、天然存在的突变、沉默突变(silent mutation)或保守取代的变体。
[0015]“保守取代(conservative substitution)”意指一种氨基酸被具有类似结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代。这种氨基酸取代可通常基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性(amphipathic nature)性质的类似性而发生。通常，保守取代可能几乎不影响或不影响蛋白或多肽的活性。
[0016]在本公开中，术语“变体(variant)”是指氨基酸序列与通过一个或多个氨基酸的保守取代和/或修饰而变异之前的变体的氨基酸序列不同但维持功能或性质的多肽。这种变体通常可以通过修饰多肽氨基酸序列的一个或多个氨基酸并评估修饰多肽的性质来鉴别。换句话讲，与变异之前多肽的能力相比，变体的能力可能增加、不变或降低。些变体可包括除去了一个或多个部分诸如N末端前导序列或跨膜结构域(transmembrane domain)的变体。其他变体可包括将N末端和/或C末端的一部分从成熟蛋白(mature protein)除去的变体。术语“变体”可与术语诸如修饰、修饰多肽、修饰蛋白、突变体、突变蛋白和趋异(modification,modified polypeptide,modified protein,mutant,mutein,divergent)互换使用，并且不限于此，只要其为以变异含义使用的术语即可。出于本公开的目的，变体可为包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列的多肽，其中作为对应于SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第676位的氨基酸的天冬氨酸(Asp或D)被酪氨酸(Tyr或Y)取代。
[0017]变体可包括对多肽的性质和二级结构具有最小影响的氨基酸的缺失或添加。例如，共翻译或翻译后参与蛋白易位(translocation)的信号(或前导)序列可与变体的N末端缀合。变体可与其他序列或接头缀合，以便被鉴别、纯化或合成。
[0018]本公开中，术语“同源性(homology)”或“同一性(identity)”意指两个给定氨基酸序列或碱基序列之间的类似程度且可以百分比的形式表示。术语同源性和同一性常常可互换使用。
[0019]保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性由标准比对算法确定，并且可以一起使用由所用程序建立的默认空位罚分。基本上，具有同源性(homologous)的或同一性(identical)的序列通常能够在中等或高度严格的条件下与序列整体或一部分杂交。明显的是，杂交还包括多核苷酸与包含通用密码子或考虑到密码子简并性的密码子的多核苷酸的杂交。
[0020]任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、类似性或同一性可以使用已知的计算机算法诸如“FASTA”程序，例如使用如Pearson等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444中的默认参数来确定。此外，同源性、类似性或同一性可使用如EMBOSS包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等人,2000,Trends Genet.16:276
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277)(版本5.0.0或之后版本)(包括GCG程序包
(Devereux,J.等人,Nucleic Acids Research 12:387(1984))的Needleman程序中所执行的Needleman
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Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443
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453)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.等人,J MOLEC BIOL 215:403(1990)；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop编,Academic Press,San Diego,1994；以及CARILLO等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)来确定。例如，可使用美国国家生物技术信息中心的BLAST或ClustalW确定同源性、类似性或同一性。
[0021]多核苷酸或多肽的同源性、类似性或同一性可如例如Smith和Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482中所发表的通过使用例如GAP计算机程序诸如Needleman等人(1970),J Mol Biol.48:443比较序列信息来确定。概括地说，GAP程序可定义为通过两个序列中的较短序列中符号(即，核苷酸或氨基酸)的总数除以类似比对符号的数目所获得的值。GAP程序的默认参数可包括(1)二元比较矩阵(包括相同值为1且非同值为0)和Gribsko等人,(1986)Nucl.Acids Res.14:6745(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵)的加权比较矩阵，如Schwartz和Dayhoff编,Atlas Of Protein Sequence And Structure,National Biomedical Research Foundation,第353
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358页(1979)中所公开；(2)每个空位的罚分为3.0并且每个空位的每个符号额外罚分0.10(或空位开放罚分为10，空位延伸罚分为0.5)；以及(3)末端空位没有罚分。
[0022]本公开的变体可表现出使得L
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赖氨酸生产能力与野生型多肽相比增加的活性。
[0023]本公开的包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽和/或变体可以表现出由NCgl0752基因编码的蛋白质的活性，但不限于此。
[0024]在本公开中，术语“对应于”是指多肽中所列出的位置处的氨基酸残基，或者与多肽中所列出的残基类似、相同或同源的氨基酸残基。鉴别对应位置处的氨基酸可为确定参考特定序列的序列中的特定氨基酸。如本文所用，“对应区域”通常是指相关蛋白或参考(reference)蛋白中类似或对应的位置。
[0025]例如，将任意氨基酸序列与SEQ ID NO:3比对(align)，并且基于此，可以参考SEQ ID NO:3的氨基酸残基和对应氨基酸残基的数值位置对上述氨基酸序列的每个氨基酸残基进行编号。例如，如本公开中所述的序列比对算法可通过与查询序列(也称为“参本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种蛋白变体，其由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列组成，其中，作为对应于SEQ ID NO:3的第676位的氨基酸的天冬氨酸被酪氨酸取代。2.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1所述的变体。3.一种谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌株，其包含根据权利要求1所述的变体或编码所述变体的多核苷酸。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：张真淑，李翰衡，金惠美，朴素静，金柄秀，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：