具有L-脯氨酸外排功能的蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有L

【技术实现步骤摘要】
具有L
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脯氨酸外排功能的蛋白及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学和生物工程领域，具体涉及一种谷氨酸棒杆菌的苏氨酸外排蛋白ThrE作为L
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脯氨酸外排蛋白的新用途，以及利用蛋白ThrE生产L
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脯氨酸及其衍生物的方法。

技术介绍

[0002]L
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脯氨酸，是天然存在的一种人体的非必需氨基酸，在临床、生物材料和工业等方面有广泛的应用。L
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脯氨酸的生产方法主要有化学法和发酵法，由于化学提取法污染严重成本高，已逐渐失去市场，微生物发酵法由于具有生产成本低、生产强度高、高特异性和对环境污染小等优点而成为当今工业应用最广泛的方法。目前，常用的工业发酵菌株有棒杆菌和埃希氏菌，常用的埃希氏菌如大肠杆菌(Escherichia coli)，常用的棒杆菌如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，短杆菌如黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentus)，以及节杆菌属的某些种和微杆菌属的某些种。而由于谷氨酸棒杆菌的生理优越性，已成为工业中最重要的生产菌株用来生产氨基酸等产品。
[0003]在棒杆菌中，主要以谷氨酸为底物经过γ
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谷氨酰激酶(Glutamate
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kinase，ProB)、谷氨酸半醛脱氢酶(Glutamate
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semialdehyde dehydrogenase，ProA)、吡咯啉
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羧酸还原酶(Pyrroline
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carboxylic acid reductase，ProC)催化后生产L
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脯氨酸。现有技术主要通过对L
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脯氨酸合成途径的关键酶ProA、ProB的遗传改造生产L
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脯氨酸，如CN101084312A报道了谷氨酸棒杆菌来源的ProB蛋白的149位突变可以解除L
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脯氨酸的反馈抑制，提高工程菌株L
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脯氨酸的产量。
[0004]在发酵过程中，通过转运途径将微生物体内合成的氨基酸及时转运到胞外，对于促进氨基酸的生物合成也十分重要，比如在赖氨酸的生产过程中，通过赖氨酸外排蛋白LysE的过表达，可以将工程菌株的赖氨酸产量显著提高(CN1283797C)。然而，在L
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脯氨酸生产过程中，尚未有利用L
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脯氨酸外排蛋白来提高L
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脯氨酸产量的报道。因此，本领域急需挖掘有效的L
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脯氨酸外排蛋白，以便将胞内生产的L
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脯氨酸高效地排到胞外，获得高产的L
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脯氨酸工程菌。

技术实现思路

[0005]为克服现有技术中的问题，本专利技术通过全基因组规模膜转运蛋白抑制库筛选谷氨酸棒杆菌的L
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脯氨酸外排蛋白。基于此筛选，本专利技术筛选到thrE(Cgl2622，已有文献证实为苏氨酸外排蛋白的编码基因)基因抑制后，L
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脯氨酸比产率下降明显。在一个L
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脯氨酸生产菌SZCgP1(谷氨酸棒杆菌ATCC13869引入ProB蛋白的G149D突变，密码子从GGT突变为GAT，具体参见CN101084312A)中过表达ThrE，在整个发酵过程的胞外脯氨酸浓度都明显高于对照菌株SZCgP1(pEC
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control)，在整个发酵过程(特别是快速产酸期)的胞内脯氨酸浓度都明显低于对照菌株SZCgP1(pEC
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control)。上述结果表明ThrE是一个L
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脯氨酸外排蛋白。
[0006]本专利技术的目的之一是提供脯氨酸外排蛋白在生产L
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脯氨酸或羟脯氨酸中的用途。
[0007]本专利技术的又一目的是提供一种L
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脯氨酸或羟脯氨酸的生产菌株。
[0008]本专利技术的另一目的是提供一种生产L
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脯氨酸或羟脯氨酸的方法。
[0009]本专利技术的再一目的是提供一种L
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脯氨酸或羟脯氨酸生产菌株的构建方法。
[0010]在本专利技术的第一方面，提供了一种多肽作为脯氨酸外排蛋白在生产L
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脯氨酸、羟脯氨酸中的用途，所述多肽是：
[0011]A)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；或
[0012]B)在A)所述多肽的两端的任意一端或两端添加、缺失部分氨基酸而仍然具有L
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脯氨酸外排功能活性的多肽；或
[0013]C)与A)所述多肽同源性高于90％、95％、96％、97％、98％或99％，且来源于棒杆菌属的具有L
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脯氨酸外排功能活性的多肽。
[0014]在另一优选例中，所述多肽是从SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽，由SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列在两端的任意一端或两端经过一个或几个，优选1
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20个、更优选1
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15个、更优选1
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10个、更优选1
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3个、最优选1个氨基酸残基的添加而形成，并且具有L
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脯氨酸外排功能。
[0015]在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
[0016]在本专利技术的第二方面，提供了一种L
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脯氨酸的生产菌株，其特征在于，所述菌株表达以下多肽：
[0017]A)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；或
[0018]B)在A)所述多肽的两端的任意一端或两端添加、缺失部分氨基酸而仍然具有L
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脯氨酸外排功能活性的多肽；或
[0019]C)与A)所述多肽同源性高于90％、95％、96％、97％、98％或99％，且来源于棒杆菌属的具有L
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脯氨酸外排功能活性的多肽。
[0020]在另一优选例中，所述多肽是从SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽，由SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列在两端的任意一端或两端经过一个或几个，优选1
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20个、更优选1
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15个、更优选1
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10个、更优选1
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3个、最优选1个氨基酸残基的添加而形成，并且具有L
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脯氨酸外排功能。
[0021]在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
[0022]在另一优选例中，所述生产菌株是细菌。
[0023]在另一优选例中，所述生产菌株选自埃希氏菌属或棒杆菌属，优选大肠杆本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多肽在生产L
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脯氨酸或羟脯氨酸中的用途，其特征在于，所述多肽是：A)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；或B)在A)所述多肽的两端的任意一端或两端添加、缺失部分氨基酸而仍然具有L
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脯氨酸外排功能活性的多肽；或C)与A)所述多肽同源性高于90％、95％、96％、97％、98％或99％，且来源于棒杆菌属的具有L
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脯氨酸外排功能活性的多肽；优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。2.一种L
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脯氨酸的生产菌株，其特征在于，所述菌株表达以下多肽：A)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；或B)在A)所述多肽的两端的任意一端或两端添加、缺失部分氨基酸而仍然具有L
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脯氨酸外排功能活性的多肽；或C)与A)所述多肽同源性高于90％、95％、96％、97％、98％或99％，且来源于棒杆菌属的具有L
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脯氨酸外排功能活性的多肽；优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示；优选地，所述的生产菌株是细菌；优选地，所述的生产菌株选自埃希氏菌属或棒杆菌属，优选大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌，进一步优选为谷氨酸棒杆菌，更具体的是谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC13869、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067；进一步优选地，所述的生产细菌中的谷氨酸激酶不受L
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脯氨酸的反馈抑制或L
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脯氨酸的反馈抑制减弱；更进一步优选地，所述的生产细菌中谷氨酸激酶和/或谷氨酸半醛脱氢酶和/或吡咯啉
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羧酸还原酶的活性增强。3.一种生产L
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脯氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：培养权利要求2所述的生产菌株，使之生产L
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脯氨酸；优选地，所述方法还包括从发酵液中分离L
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脯氨酸的步骤。4.一种L
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脯氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，所述方法包括增强所述菌株中以下多肽的活性：A)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；或B)在A)所述多肽的两端的任意一端或两端添加、缺失部分氨基酸而仍然具有L
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脯氨酸外排功能活性的多肽；或C)与A)所述多肽同源性高于90％、95％、96％、97％、98％或99％，且来源于棒杆菌属的具有L
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脯氨酸外排功能活性的多肽；优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示；优选地，所述的生产菌株是细菌；优选地，所述的生产菌株选自埃希氏菌属或棒杆菌属，优选大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌，进一步优选为谷氨酸棒杆菌，更具体的是谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC13869、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067；进一步优选地，所述生产细菌中的谷氨酸激酶不受L
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脯氨酸的反馈抑制或L
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【专利技术属性】
技术研发人员：孙际宾，刘娇，郑平，刘莫识，王钰，周文娟，孙冠男，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：