颗粒蛋白前体变体制造技术

本文提供了颗粒蛋白前体变体以及包含颗粒蛋白前体变体和Fc多肽的融合蛋白。本文还提供了使用此类蛋白质治疗颗粒蛋白前体相关病症(例如神经退行性疾病，如额颞叶痴呆(FTD))的方法。的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】颗粒蛋白前体变体
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年12月23日提交的美国临时申请第62/953,099号和2020年10月14日提交的美国临时申请第63/091,819号的优先权，所述临时申请的公开内容出于所有目的通过引用整体并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请含有序列表，所述序列表已以ASCII格式电子提交并在此通过引用整体并入。所述ASCII副本创建于2020年12月14日，命名为102342
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003920PC
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1219188_SL.txt并且大小为543,756字节。

技术介绍

[0005]额颞叶痴呆(FTD)是一种进行性神经退行性病症，其占所有痴呆患者的5
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10％以及65岁前痴呆发作患者的10
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20％(Rademakers等人,Nat Rev Neurol.8(8):423
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34,2012)。尽管若干基因已与FTD相关联，但FTD中最频繁突变的基因之一是GRN，其定位至人类染色体17q21并编码富半胱氨酸蛋白颗粒蛋白前体(progranulin，PGRN)(也称为上皮素前体(proepithelin)和顶颗粒蛋白(acrogranin))。GRN中的高度渗透性突变于2006年首次报道为家族性FTD的体染色体显性形式的原因(Baker等人,Nature.442(7105):916
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9,2006；Cruts等人,Nature.2006年8月24日；442(7105):920
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4；Gass等人,Hum Mol Genet.15(20):2988
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3001,2006)。最新估计表明GRN突变占具有阳性家族史的FTD患者的5
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20％和散发病例的1
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5％(Rademakers等人,同上)。
[0006]将GRN突变鉴定为FTD的原因之后，颗粒蛋白前体的水平降低和颗粒蛋白前体的功能损失已与多种神经退行性疾病和病症相关联，所述疾病和病症包括阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)、帕金森病(Parkinson's Disease，PD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和由溶酶体贮积病引起的神经退行性病症(Petkau和Leavitt.2014.Trends Neurosci 37(7):388
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398)。因此，需要开发可处理由颗粒蛋白前体的功能损失和颗粒蛋白前体的水平降低引起的病症或得益于颗粒蛋白前体的水平增加的病症的疗法。

技术实现思路

[0007]本文提供了颗粒蛋白前体变体和包含颗粒蛋白前体或其变体的融合蛋白以及使用此类变体或融合蛋白来治疗得益于颗粒蛋白前体的水平增加的任何疾病的方法，所述疾病包括神经退行性疾病(例如FTD)、动脉粥样硬化、与TDP
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43相关的病症、年龄相关性黄斑变性(AMD)或颗粒蛋白前体相关病症。本文所提供的颗粒蛋白前体变体具有对野生型颗粒蛋白前体的C末端进行的修饰或添加。如本文所述，与含有野生型颗粒蛋白前体的融合蛋白相比，当从中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中重组表达和纯化蛋白质时，含有颗粒蛋白前体变体的融合蛋白在蛋白质的颗粒蛋白前体部分中不易发生C末端切割。
[0008]在一个方面，本公开提供一种颗粒蛋白前体变体，所述颗粒蛋白前体变体包含与SEQ ID NO:2具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
两者均不存在。
[0019]在另一个方面，本公开提供一种包含颗粒蛋白前体变体的多肽，所述颗粒蛋白前体变体包含与SEQ ID NO:2具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性或100％同一性的序列和在对应于SEQ ID NO:2的残基574至576的位置处由X1X2X3定义的序列，其中X1、X2和X3各自独立地为氨基酸并且合在一起不为QLL。在一些实施方案中，多肽中的颗粒蛋白前体变体与SEQ ID NO:2具有至少95％(例如至少96％、97％、98％或99％)同一性。在一些实施方案中，多肽中的颗粒蛋白前体变体包含与SEQ ID NO:2具有至少95％(例如至少96％、97％、98％或99％)同一性的序列。
[0020]在这个方面的一些实施方案中，多肽中的颗粒蛋白前体变体包含序列：
[0021]TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRX1X2X3(SEQ ID NO:3)。
[0022]其中X1X2X3不为QQL。
[0023]在这个方面的一些实施方案中，X1为R、H、K、D、E、S、T、N、Q、L、F、Y、P或V。在一些实施方案中，X2为H、K、D、E、S、T、N、Q、G、P、A、Y、V、I、F、L或R。在一些实施方案中，X3为L、Y或P。
[0024]在一些实施方案中，X1X2X3为X1IL。在某些实施方案中，X1IL中的X1可为R、H、K、E、P、N、F或Y(例如R、H、K、E或P)。
[0025]在一些实施方案中，X1X2X3为X1FL。在某些实施方案中，X1FL中的X1可为R、H、K、D、E、S、T、N、Q、L、F、Y或P。
[0026]在一些实施方案中，X1X2X3为X1QL。在某些实施方案中，X1QL中的X1可为R、H、K、D、E、N、L、F、Y或Q。
[0027]在一些实施方案中，X1X2X3为PX2L。在某些实施方案中，PX2L中的X2可为H、K、D、E、S、T、N、Q、G、P、A、Y、V、I、F、L或R(例如H、K本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种颗粒蛋白前体变体，所述颗粒蛋白前体变体包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的序列和在对应于SEQ ID NO:2的残基574至576的位置处由X1X2X3定义的序列，其中X1、X2和X3各自独立地为氨基酸并且合在一起不为QLL。2.如权利要求1所述的颗粒蛋白前体变体，其中所述颗粒蛋白前体变体与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性。3.如权利要求1或2所述的颗粒蛋白前体变体，其中所述颗粒蛋白前体变体与SEQ ID NO:2具有至少98％同一性。4.如权利要求1至3中任一项所述的颗粒蛋白前体变体，其中所述颗粒蛋白前体变体与SEQ ID NO:2具有至少99％同一性。5.如权利要求1所述的颗粒蛋白前体变体，其中所述颗粒蛋白前体变体包含与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的序列。6.如权利要求1或5所述的颗粒蛋白前体变体，其中所述颗粒蛋白前体变体包含与SEQ ID NO:2具有至少98％同一性的序列。7.如权利要求1、5和6中任一项所述的颗粒蛋白前体变体，其中所述颗粒蛋白前体变体包含与SEQ ID NO:2具有至少99％同一性的序列。8.如权利要求1至7中任一项所述的颗粒蛋白前体变体，其中所述颗粒蛋白前体变体具有序列：TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRX1X2X3(SEQ ID NO:3)。9.如权利要求1至8中任一项所述的颗粒蛋白前体变体，其中X1为R、H、K、D、E、S、T、N、Q、L、F、Y、P或V。10.如权利要求1至9中任一项所述的颗粒蛋白前体变体，其中X2为H、K、D、E、S、T、N、Q、G、P、A、Y、V、I、F、L或R。11.如权利要求1至10中任一项所述的颗粒蛋白前体变体，其中X3为L、Y或P。12.如权利要求1至11中任一项所述的颗粒蛋白前体变体，其中X1X2X3为X1IL、X1FL、X1QL、PX2L、QX2L或VX2L。13.如权利要求1至11中任一项所述的颗粒蛋白前体变体，其中X1X2X3为X1X2L。14.如权利要求13所述的颗粒蛋白前体变体，其中X2为A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、K、M、F、P、S、T、W、Y或V。15.如权利要求1至11中任一项所述的颗粒蛋白前体变体，其中X1X2X3为PIL、PFL、QQL、VVL或VTL。16.如权利要求1至11中任一项所述的颗粒蛋白前体变体，其中X1X2X3为PPL、PYL、QQL、QHL或QRL。
17.一种颗粒蛋白前体变体，所述颗粒蛋白前体变体包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的序列和在对应于SEQ ID NO:2的残基576的位置的相邻和C末端处由Y1Y2QLL定义的序列(SEQ ID NO:137)，其中Y1为L或不存在，并且Y2为R或不存在。18.如权利要求17所述的颗粒蛋白前体变体，其中所述颗粒蛋白前体变体包含序列：TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLLY1Y2QLL(SEQ ID NO:55)，其中Y1为L或不存在，并且Y2为R或不存在。19.如权利要求17或18所述的颗粒蛋白前体变体，其中Y1为L。20.如权利要求17至19中任一项所述的颗粒蛋白前体变体，其中Y2为R。21.如权利要求17或18所述的颗粒蛋白前体变体，其中Y1和Y2两者均不存在。22.一种包含颗粒蛋白前体变体的多肽，所述颗粒蛋白前体变体包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的序列和在对应于SEQ ID NO:2的残基574至576的位置处由X1X2X3定义的序列，其中X1、X2和X3各自独立地为氨基酸并且合在一起不为QLL。23.如权利要求22所述的多肽，其中所述颗粒蛋白前体变体与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性。24.如权利要求22或23所述的多肽，其中所述颗粒蛋白前体变体与SEQ ID NO:2具有至少98％同一性。25.如权利要求22至24中任一项所述的多肽，其中所述颗粒蛋白前体变体与SEQ ID NO:2具有至少99％同一性。26.如权利要求22至25中任一项所述的多肽，其中所述颗粒蛋白前体变体具有序列：TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRX1X2X3(SEQ ID NO:3)。27.如权利要求22至26中任一项所述的多肽，其中X1为R、H、K、D、E、S、T、N、Q、L、F、Y、P或V。28.如权利要求22至27中任一项所述的多肽，其中X2为H、K、D、E、S、T、N、Q、G、P、A、Y、V、I、F、L或R。29.如权利要求22至28中任一项所述的多肽，其中X3为L、Y或P。
(SEQ ID NO:91)。55.如权利要求48至54中任一项所述的多肽，其中所述Fc多肽包含选自由SEQ ID NO:64
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67组成的组的序列。56.如权利要求48至54中任一项所述的多肽，其中所述Fc多肽是特异性结合至转铁蛋白受体的经修饰的Fc多肽。57.如权利要求56所述的多肽，其中所述Fc多肽包含选自由SEQ ID NO:68
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87和129
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132组成的组的序列。58.如权利要求57所述的多肽，其中所述Fc多肽包含选自SEQ ID NO:70、75、80、85和129
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132的序列。59.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：(a)如权利要求1至21中任一项所述的颗粒蛋白前体变体；(b)连接至(a)的所述颗粒蛋白前体变体的第一Fc多肽；和(c)与所述第一Fc多肽形成Fc多肽二聚体的第二Fc多肽。60.如权利要求59所述的融合蛋白，其中所述第二Fc多肽连接至如权利要求1至21中任一项所述的第二颗粒蛋白前体变体。61.如权利要求59或60所述的融合蛋白，其中所述第一Fc多肽是由肽键或由多肽接头连接至所述颗粒蛋白前体变体，和/或所述第二Fc多肽是由肽键或由多肽接头连接至所述颗粒蛋白前体变体。62.如权利要求61所述的融合蛋白，其中所述多肽接头的长度为1至50个氨基酸。63.如权利要求61或62所述的融合蛋白，其中所述多肽接头是柔性多肽接头。64.如权利要求63所述的融合蛋白，其中所述柔性多肽接头是富甘氨酸接头。65.如权利要求64所述的融合蛋白，其中所述富甘氨酸接头是G4S(SEQ ID NO:90)或(G4S)2(SEQ ID NO:91)。66.如权利要求59至65中任一项所述的融合蛋白，其中所述第一Fc多肽的C末端连接至所述颗粒蛋白前体的N末端，和/或所述第二Fc多肽的C末端连接至所述颗粒蛋白前体变体的N末端。67.如权利要求59至66中任一项所述的融合蛋白，其中所述第一Fc多肽或所述第二Fc多肽特异性结合至转铁蛋白受体。68.如权利要求59至67中任一项所述的融合蛋白，其中所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽各自包含促进异二聚化的修饰。69.如权利要求68所述的融合蛋白，其中：(i)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含T366W取代并且所述第二Fc多肽包含T366S、L368A和Y407V取代；或(ii)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含T366S、L368A和Y407V取代并且所述第二...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰拉尔德，
申请(专利权)人：戴纳立制药公司，
类型：发明
国别省市：