CD36基因人源化非人动物的构建方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种人源化CD36蛋白、一种人源化CD36基因、一种CD36基因的靶向载体、一种CD36基因人源化的非人动物及其构建方法和其在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将编码人CD36蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化CD36蛋白，可以作为人CD36信号机理研究、肿瘤及自身免疫性疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。的新药研发具有重要的应用价值。的新药研发具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
CD36基因人源化非人动物的构建方法及应用


[0001]本专利技术属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种CD36基因改造非人动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

技术介绍

[0002]CD36(Cluster of differentiation 36)也称为血小板糖蛋白4，脂肪酸转位酶(FAT)，清道夫受体B类成员3(SCARB3)，糖蛋白88(GP88)，GPIIIB，GPIV，属于细胞表面蛋白B类清道夫受体家族的成员。主要表达在毛细血管内皮细胞、乳腺分泌上皮细胞、分化脂肪细胞、血小板、红细胞、单核细胞、B细胞、巨噬细胞、骨骼肌细胞等表面。CD36还在多种肿瘤细胞上表达，与乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌、口腔鳞状细胞癌和急性髓性白血病等不良预后有关。其配体包括：胶原蛋白、血小板反应蛋白(TSP
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1)、被恶性疟原虫寄生的红细胞、氧化低密度脂蛋白(oxLDL)、天然脂蛋白、氧化磷脂和长链脂肪酸(FA)等，CD36功能多样性取决于不同配体的结合：a.作为脂质转氨酶，CD36可以识别和内吞变性LDL(oxLDL和AcLDL)，导致巨噬细胞泡沫化，分泌各种炎性细胞因子，启动动脉粥样硬化的发生；b.在巨噬细胞上，CD36形成非调理素受体(CD36/αVβ3复合物)的一部分，参与吞噬作用；c.巨噬细胞和DC细胞上的CD36还可以结合热休克蛋白gp96，通过释放细胞因子，趋化因子和氮氧化物刺激机体免疫反应；d.识别外源性物质，例如恶性疟原虫感染的红细胞以及葡萄球菌和分枝杆菌的细胞壁成分，发挥先天免疫功能；e.识别内源性配体，巨噬细胞上的CD36可以结合β
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淀粉样肽，在阿尔茨海默症中有一定作用；f.通过TLR2/6或TLR4/6异二聚体的组装促进无菌炎症；g.在肿瘤微环境中，肿瘤微血管内皮细胞上的CD36通过结合TSP
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1促进血管细胞凋亡，同时招募Src家族成员介导VEGFR2去磷酸化，抑制VEGF通路，从而导致抗血管生成。另外，CD36能激活Wnt/TGF
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β信号通过EMT促进肿瘤转移，也会吸收脂质分子使免疫细胞内的脂质沉积，导致DC细胞内的无菌性炎症和抗原递呈功能障碍，从而诱发肿瘤免疫抑制，起始肿瘤细胞的生长、侵袭和转移。
[0003]实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。
[0004]随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因的复杂性，例如，人
和小鼠CD36蛋白的一致性为84％，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战。
[0005]鉴于CD36复杂的作用机制，以及在肿瘤治疗领域的巨大应用价值，为进一步探索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发CD36相关信号通路的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本专利技术在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一方面，提供了一种人源化CD36蛋白，所述的人源化CD36蛋白包含人CD36蛋白的全部或部分。
[0007]优选的，所述的人源化CD36蛋白包含人CD36蛋白的跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化CD36蛋白包含人CD36蛋白的胞外区的全部或部分。
[0008]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化CD36蛋白包含人CD36蛋白胞外区的全部或部分，优选的，包含至少50个连续氨基酸的人CD36蛋白胞外区，例如至少包含50、70、100、130、150、170、200、230、250、270、300、320、350、360、370、390、400、405、406、407、408、409、410个连续氨基酸的人CD36蛋白胞外区，进一步优选的，包含410个连续氨基酸的人CD36蛋白胞外区；更优选的，包含与SEQ ID NO:2的第30
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439位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第30
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439位所示氨基酸序列。
[0009]优选的，所述的人源化CD36蛋白还包含非人动物CD36蛋白的部分，进一步优选的，所述的非人动物CD36蛋白的部分为非人动物CD36蛋白的跨膜区和/或胞质区的全部或部分。优选包含SEQ ID NO：1第1
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29位和/或第440
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472位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1第1
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29位和/或第440
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472位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：1第1
‑
29位和/或第440
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472位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：1第1
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29位和/或第440
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472位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，或者，优选包含SEQ ID NO：1第8
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29位、第440
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461位、第1
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7位或第462
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472位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1第8
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29位、第440
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461位、第1
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7位或第462
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472位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：1第8
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29位、第440
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461位、第1...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人源化CD36蛋白，其特征在于，所述的人源化CD36蛋白包含人CD36蛋白的全部或部分。2.根据权利要求1所述的人源化CD36蛋白，其特征在于，所述的人源化CD36蛋白包含人CD36蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分，优选的，所述的人源化CD36蛋白包含人CD36蛋白的胞外区的全部或部分，进一步优选的，包含人CD36蛋白的胞外区至少50个连续氨基酸，更优选包含SEQ ID NO：2第30
‑
439位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第30
‑
439位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第30
‑
439位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第30
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439位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，优选的，所述的人源化CD36蛋白还包含非人动物CD36蛋白的跨膜区和/或胞质区的全部或部分。3.根据权利要求1或2所述的人源化CD36蛋白，其特征在于，所述的人源化CD36蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：A)SEQ ID NO：11所示氨基酸序列；B)与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；C)与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或D)与SEQ ID NO：11所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。4.一种编码权利要求1
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3任一项所述人源化CD36蛋白的核酸。5.一种人源化CD36基因，其特征在于，所述的人源化CD36基因包含人CD36基因的部分。6.根据权利要求5所述的人源化CD36基因，其特征在于，所述的人源化CD36基因包含人CD36基因的1号至14号外显子的全部或部分，优选的，包含3号至14号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含3号外显子的部分、4号外显子至13号外显子的全部和14号外显子的部分，其中，3号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，14号外显子的部分至少包含30bp的核苷酸序列。7.根据权利要求5或6所述的人源化CD36基因，其特征在于，所述的人源化CD36基因包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。8.根据权利要求5
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7任一项所述的人源化CD36基因，其特征在于，所述的人源化CD36基因还包含非人动物CD36基因部分，优选包含非人动物CD36基因的1
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3号和/或16号外显子的全部或部分，进一步优选还包含4号外显子的部分和/或15号外显子的部分核苷酸序列。9.根据权利要求5
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8任一项所述的人源化CD36基因，其特征在于，所述的人源化CD36基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：A)转录的mRNA为SEQ ID NO：10所示核苷酸序列；
B)转录的mRNA与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；C)转录的mRNA与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或，E)包含SEQ ID NO：6和/或7所示的核苷酸序列。10.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含下列组中的一种：A)编码人或人源化CD36蛋白的核苷酸序列；B)编码人CD36蛋白的胞外区、跨膜区、胞质区和/或信号肽的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人CD36蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分；C)人或人源化CD36基因的核苷酸序列；或，D)人CD36基因的1号至14号外显子的全部或部分，优选的，人CD36基因的3号至14号外显子的全部或部分，进一步优选的，人CD36基因的3号外显子的部分、4号外显子至13号外显子的全部和14号外显子的部分，其中，3号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，14号外显子的部分至少包含30bp的核苷酸序列，进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。11...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘畅，尚诚彰，李惠琳，
申请(专利权)人：百奥赛图北京医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：