一种基于平衡基因表达高效合成核黄素的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于平衡基因表达高效合成核黄素的方法，属于合成生物学技术领域。本发明专利技术通过生成可调基因间区文库(TIGR)来调节操纵子内mCherry和egfp基因的表达，并确认两个报告基因的相对表达。TIGR文库可以协调报告基因在大肠杆菌中的表达率超过180倍，在枯草芽孢杆菌中的表达率超过70倍。使用TIGR文库调节zwf、ribBA和ywlf基因的表达，以增加核黄素的生物合成。根据核黄素的荧光特性，用96孔板快速筛选出最佳组合突变体。筛选出最佳工程菌，其核黄素产量为2.7g/L，在摇瓶中增加64.35％。最后，在补料分批发酵中，核黄素效价增加59.27％，达到11.77g/L。将有助于枯草杆菌核黄素及相关产品的工业化生产。核黄素及相关产品的工业化生产。核黄素及相关产品的工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种基于平衡基因表达高效合成核黄素的方法


[0001]本专利技术涉及一种基于平衡基因表达高效合成核黄素的方法，具体涉及mRNA工程平衡操纵子内基因表达高效合成核黄素的策略，属于合成生物学


技术介绍

[0002]核黄素(VB2)是人类和动物必需的营养素，广泛用于制药、食品添加剂和化妆品。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种革兰氏阳性细菌，通过“经典”菌株改良策略具有优异的核黄素生产性能。前体供应被认为是核黄素生物合成的主要限制因素。在枯草杆菌中，葡萄糖
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磷酸酶脱氢酶(由zwf编码)和6
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磷酸葡萄糖酸脱氢酶(由gnd编码)通过磷酸戊糖(PP)途径将葡萄糖
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磷酸转化为核酮糖
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磷酸。核黄素是由直接前体5
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磷酸核糖和三磷酸鸟苷(GTP)经核黄素合成途径，由rib操纵子编码的一系列酶催化合成的。基因ribBA编码一种双功能GTP环水解酶II/3,4
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二羟基
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丁酮4
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磷酸合酶，该合酶催化从核酮糖
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磷酸和2,5
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二氨基
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核糖氨基
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4(3H)
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嘧啶酮
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50
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磷酸(DARPP)合成3,4
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二羟基
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丁酮4
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磷酸(DHPB)。增加基因ribBA编码的酶的活性可使核黄素的效价增加25％。磷酸核糖焦磷酸盐(PRPP)是细胞中通过从头嘌呤途径形成的GTP前体，首先转化为肌苷单磷酸(IMP)，然后IMP随后转化为GTP。谷氨酸棒杆菌突变基因zwf243和gnd361的联合过表达使补料分批发酵中的核黄素产量增加了39％。通过在培养基中添加额外的GTP，并通过代谢工程策略将代谢重新定向到嘌呤途径，核黄素产量显著增加。因此，GTP是核黄素合成的主要限制因素。通过代谢工程策略消除反馈抑制，核黄素产量增加了3倍。通过增加PP途径的代谢流量和增加细胞内嘌呤途径前体PRPP的供应，可以显著提高核黄素的产量。
[0003]基因缺失和过度表达已成为传统代谢工程和基因功能研究的主要策略。在大肠杆菌中，过度表达和敲除技术用于上调或下调基因表达，以促进天然和非天然产物。将天然和非天然产物代谢途径引入工程菌株合成化合物时，往往需要多种酶同时参与。微调多酶催化反应系统中的蛋白质丰度，使细胞达到最佳生长和生产状态。最近的研究使用了几种策略来控制细胞内蛋白质丰度，例如启动子文库、RBS文库、5'
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UTR文库、mRNA稳定性和CRISPRi系统。这些策略用于微调基因表达水平，并控制多个基因的协调表达，以优化代谢流量。启动子是合成生物学中的关键调控元件，控制基因表达的强度和时间。通过启动子工程微调该途径的基因表达，以平衡代谢流量。为了平衡平行的多基因表达水平的平行性，一种快速且模块化的方法将基因与一组紧密的核糖体结合位点配对，这些位点可以将蛋白质丰度调节几个数量级。EMOPEC(蛋白质表达变化的经验模型和寡核苷酸)是一种基于SD(Shine Dalgarno)序列对蛋白质表达的贡献而开发的工具，可以通过改变一些碱基来调节任何大肠杆菌基因的表达水平。此外，通过生成可调基因间区文库(TIGR)、重组各种转录后控制元件和筛选所需的相对表达水平来协调操纵子中多个基因的表达，用于合成非天然产物。这种方法可以通过基因间的协同表达有效减少有毒中间代谢物的积累和蛋白质表达的冗余。
[0004]在代谢工程实践中，前体供应不足是限制目标产品产量的主要瓶颈。高水平表达
限速酶以驱动目标产物生物合成途径的代谢流量是增加前体合成的快速而直接的策略。复杂化合物，尤其是天然产物，通常由多种前体通过一系列酶促反应进行催化。例如，阿片类物质蒂巴因和氢可酮的生物合成途径包含21和23种来自植物、哺乳动物、酵母和细菌的酶反应。细胞中前体的比例直接影响化合物的合成效率。浓度最低的前体将成为限制因素，而浓度较高的前体可能对细胞有毒。在生产过程中，基因表达必须适当，以避免速率限制和有毒前体的积累。基于合成生物学的各种策略已被开发用于平衡细胞内代谢，包括启动子工程、RBS文库和动态控制。
[0005]在枯草芽孢杆菌合成核黄素的过程中，前体供应不足是限制进一步提高核黄素产量的主要因素，目前单纯的通过表达和敲除代谢途径关键基因虽然可以促进核黄素的合成，并不能使细胞内平衡代谢流的平衡，而细胞内代谢流分配失衡导致副产物增多，造成资源浪费的现象。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供一种能够高效有效调节细胞内代谢平衡的策略，并用此策略构建高产核黄素的工程菌株，并且采用该基因工程菌生产核黄素，解除发酵过程中的代谢流不平衡限制，提高核黄素产量。设计了一个基因间可调区域库(TIGRs)来调节合成操纵子内多个基因的表达。TIGRs文库由mRNA的二级结构、RNA酶切割位点和RBS序列组成，并用来控制mRNA的加工和稳定。操纵子内基因转录成完整的mRNA链，通过细胞内的RNase E(来源于大肠杆菌基因rne编码)识别TIGR序列上的特殊位点，将mRNA分割成单个转录单元，同时每个转录单元形成独特的5
’
和3
’
结构，通过影响mRNA的稳定性和RBS的结构，进而影响蛋白水平。
[0007]本专利技术提供了一种调节基因表达量的元件，所述元件由mRNA二级结构、RNase E切割位点和RBS序列组成，所述元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0008]本专利技术提供了一种调控基因表达的方法，利用所述的元件调控基因的表达，所述基因为两个或多个；
[0009]所述方法为：
[0010](1)利用权利要求1所述的元件将基因连接，并整合至表达载体上构建得到重组质粒；
[0011](2)将重组质粒转入大肠杆菌中，利用表达载体上的抗性基因筛选阳性转化子；
[0012](3)从阳性转化子中提取质粒，转入整合了RNase E基因的宿主细胞中得到重组细胞，将重组细胞进行培养并检测荧光强度，根据荧光强度与基因表达强度成正相关筛选对应的重组细胞。
[0013]本专利技术提供了一种生产核黄素的基因工程菌，利用所述表达元件调控zwf、ribBA和ywlf基因的表达，所述基因工程菌的基因组上还整合了来源于大肠杆菌的RNase E基因。
[0014]在一种实施方式中，所述基因zwf、ribBA和ywlf的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.20～22所示
[0015]在一种实施方式中，所述zwf基因和ribBA基因之间由SEQ ID NO.10、12、14、16或18连接；所述ribBA和ywlf基因之间由SEQ ID NO.11、13、15、17或18连接。
[0016]优选地，利用SEQ ID NO.14和SEQ ID N本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种调节基因表达量的元件，其特征在于，由mRNA二级结构、RNase E切割位点和RBS序列组成，所述元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。2.一种调控基因表达的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的元件调控基因的表达，所述基因为两个或多个；所述方法为：(1)利用权利要求1所述的元件将基因连接，并整合至表达载体上构建得到重组质粒；(2)将重组质粒转入整合了RNase E基因的微生物细胞中，利用表达载体上的抗性基因筛选阳性转化子；(3)从阳性转化子中提取质粒，转入表达宿主细胞中得到重组细胞，将重组细胞进行培养并检测荧光强度，根据荧光强度与基因表达强度成正相关筛选对应的重组细胞。3.一种生产核黄素的基因工程菌，其特征在于，利用所述表达元件调控zwf、ribBA和ywlf基因的表达，所述基因工程菌的基因组上还整合了来源于大肠杆菌的RNase E基因。4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述zwf基因和ribBA基因之间由SEQ ID NO.10、12、14、16或18连接；所述ribBA和ywlf基因之间由SEQ I...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，尤甲甲，杨套伟，潘学玮，张显，徐美娟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：