修饰的环状RNA及其使用方法技术

本文提供的是生成包含至少一个N6

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰的环状RNA及其使用方法
[0001]相关申请的交叉引用本申请要求于2019年8月28日提交的美国临时申请号62/892,776的优先权利益，所述美国临时申请在此通过引用整体并入。
[0002]关于序列表的声明与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且在此通过引用并入说明书内。含有序列表的文本文件的名称是STDU2_37833_101_SeqList_ST25.txt。该文件为~4kb，于2020年8月24日创建，且正以电子方式提交。


[0003]本申请涉及修饰环状RNA以减少或增加其免疫原性的方法，以及使用修饰的环状RNA的方法。

技术介绍

[0004]数以万计的环状RNA (circRNA)已在真核生物中得到鉴定。病毒如丁型肝炎病毒和植物类病毒具有环状RNA基因组，并且许多病毒产生环状RNA作为其复制周期的正常部分。最近的研究提示了部分基于circRNA的先天免疫系统正在出现的状况。某些外源性circRNA的引入可以激活抗病毒和免疫基因表达程序，而内源性circRNA可以共同抑制蛋白激酶R，并且对于病毒感染后的先天免疫设定阈值。
[0005]哺乳动物先天免疫系统依赖于识别病毒和细菌中常见的病原体相关分子模式(PAMP)的模式识别受体(PRR)。RIG
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I和MDA5是在胞质溶胶中发现的感知外来核酸的PRR。已知MDA5检测长dsRNA，而RIG
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I已显示识别短dsRNA上的5'三磷酸。尽管用于RIG
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I激活的线性RNA配体已得到广泛表征，但尚未调查RIG
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I与circRNA的相互作用，尤其是在外来circRNA检测的背景下。
[0006]N6
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甲基腺苷(m6A)是最丰富的RNA修饰之一。在mRNA上，m6A已证实调控不同的功能，包括剪接、翻译和降解，所述功能可以具有细胞和组织范围的效应。先前的研究已提示m6A也存在于circRNA上，并且具有启动不依赖于帽的翻译的潜力。然而，m6A对circRNA功能的作用及其在circRNA的RIG
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I检测中的作用尚不清楚。
[0007]仍然需要操纵环状RNA的免疫原性的组合物和方法，以便在生物技术中使用环状RNA平台。

技术实现思路

[0008]本文提供的是用于操纵环状RNA的免疫原性的组合物和方法，及其用途。
[0009]在一些实施方案中，本公开内容提供了疫苗组合物，其包含不含任何N6
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甲基腺苷(m6A)残基的环状RNA分子。
[0010]在一些实施方案中，本公开内容提供了包含编码环状RNA的DNA序列的组合物，其中所述环状RNA不含任何N6
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甲基腺苷(m6A)残基。
[0011]本公开内容还提供了用于在有需要的受试者中引发先天免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含编码如本文所述的环状RNA的DNA序列。
[0012]本公开内容还提供了用于在有需要的受试者中引发先天免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用有效量的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含不含任何m6A残基的环状RNA分子。
[0013]本文还提供的是通过体外转录用于产生环状RNA的方法，该方法包括提供编码环状RNA分子的DNA模板、核糖核苷三磷酸和RNA聚合酶；从DNA模板转录线性RNA；和使线性DNA环化，以形成环状RNA；其中所述核糖核苷三磷酸不包括任何N6
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甲基腺苷
‑5’‑
三磷酸(m6ATP)；并且其中所述环状RNA能够在受试者中产生先天免疫应答。
[0014]本文还提供的是通过体外转录用于产生环状RNA分子的方法，该方法包括提供编码环状RNA分子的DNA模板、核糖核苷三磷酸和RNA聚合酶；从DNA模板转录线性RNA；并且使线性DNA环化，以形成环状RNA；其中所述核糖核苷三磷酸包含N6
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甲基腺苷
‑5’‑
三磷酸(m6ATP)；并且其中与使用相同方法但不存在m6ATP的情况下产生的环状RNA相比，所述环状RNA是较低免疫原性的。
[0015]本公开内容提供了将物质递送至细胞的方法，其中所述方法包括：(a)生成包含至少一个N6
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甲基腺苷(m6A)的重组环状RNA分子；(b)将物质附着到重组环状RNA分子，以产生包含附着到物质的重组环状RNA分子的复合物；并且(c)使细胞与复合物接触，由此将物质递送至细胞。
[0016]本公开内容还提供了在细胞中螯合RNA结合蛋白的方法，其中所述方法包括(a)生成包含至少一个N6
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甲基腺苷(m6A)和一个或多个RNA结合蛋白结合结构域的重组环状RNA分子；并且(b)使包含RNA结合蛋白的细胞与重组环状RNA分子接触，由此所述RNA结合蛋白与一个或多个RNA结合蛋白结合结构域结合，并且在细胞中被螯合。
[0017]本公开内容进一步提供了减少环状RNA分子的先天免疫原性的方法，其中所述方法包括：(a)提供在受试者中诱导先天免疫应答的环状RNA分子；并且(b)将至少一个N6
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甲基腺苷(m6A)引入环状RNA分子内，以提供具有减少的先天免疫原性的修饰的环状RNA分子。
[0018]还提供的是增加环状RNA分子在受试者中的先天免疫原性的方法，其中所述方法包括：(a)生成缺乏RRACH基序(SEQ ID NO: 18)的环状RNA分子；并且(b)用另一种碱基(例如U、C、G或肌苷)替换环状RNA序列中的一个或多个腺苷，以提供具有增加的先天免疫原性的修饰的环状RNA分子。
附图说明
[0019]图1A包括描绘在凝胶纯化之前的circFOREIGN的琼脂糖凝胶电泳(左)和所得到的纯化RNA的TapeStation分析(右)的图像。图1B是显示了在RNA转染到HeLa细胞内之后24小时，先天免疫基因的基因表达的图。通过qRT
‑
PCR测量指示mRNA和转染RNA的相对表达，并且结果针对模拟转染之后的表达进行标准化。显示了平均值
ꢀ±ꢀ
SEM (n = 3)。*p<0.05，斯氏t检验，比较了circFOREIGN与凝胶纯化的RNA转染。图1C是circFOREIGN纯化的HPLC层析图。收集的级分在迹线(左)和纯化RNA的TapeStation分析(右)上指示。图1D是显示了在RNA转染到HeLa细胞内之后24小时，先天免疫基因的基因表达的图。通过qRT
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PCR测量指示mRNA和
转染RNA的相对表达，并且结果针对模拟转染之后的表达进行标准化。显示了平均值
ꢀ±ꢀ
SEM (n = 3)。*p<0.05，斯氏t检验，比较了circFOREIGN与用指示RNA的转染。
[0020]图2A是描绘与OVA结合的激动剂RNA的皮下注射的图解。在初本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种疫苗组合物，其包含不含任何N6
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甲基腺苷(m6A)残基的环状RNA分子。2.权利要求1的疫苗组合物，其中所述环状RNA缺乏RRACH基序。3.权利要求1
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2中任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物进一步包含至少一种抗原。4.权利要求1
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2中任一项的疫苗组合物，其中所述环状RNA分子包含可操作地连接到编码多肽的序列的内部核糖体进入位点(IRES)。5.权利要求4的疫苗组合物，其中所述编码多肽的序列编码至少一种抗原。6.权利要求3或5中任一项的疫苗组合物，其中所述至少一种抗原具有病毒、细菌、寄生虫、真菌、原生动物、朊病毒、细胞或细胞外起源。7.权利要求3或5中任一项的疫苗组合物，其中所述至少一种抗原是肿瘤抗原。8.权利要求1
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7中任一项的疫苗组合物，其中所述环状RNA分子使用体外转录产生。9.权利要求1
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8中任一项的疫苗组合物，其中所述环状RNA作为裸露RNA存在于所述组合物中。10.权利要求1
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8中任一项的疫苗组合物，其中所述环状RNA与纳米颗粒复合。11.权利要求10的疫苗组合物，其中所述纳米颗粒是聚乙烯亚胺(PEI)纳米颗粒。12.一种在有需要的受试者中引发先天免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的权利要求1
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11中任一项的疫苗组合物。13.一种包含编码环状RNA的DNA序列的组合物，其中所述环状RNA不含任何N6
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甲基腺苷(m6A)残基。14.权利要求13的组合物，其中所述DNA序列不包含任何RRACH基序。15.权利要求13或14的组合物，其中病毒或非病毒载体包含所述DNA序列。16.权利要求15的组合物，其中所述病毒载体是腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体或疱疹病毒载体。17.权利要求15的组合物，其中所述非病毒载体是质粒。18.一种在有需要的受试者中引发先天免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的权利要求13
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17中任一项的组合物。19.一种通过体外转录产生环状RNA分子的方法，所述方法包括：(a)提供编码所述环状RNA分子的DNA模板、核糖核苷三磷酸和RNA聚合酶；(c)从所述DNA模板转录线性RNA；和(d)使所述线性DNA环化，以形成环状RNA；其中所述核糖核苷三磷酸不包括任何N6
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甲基腺苷
‑5’‑
三磷酸(m6ATP)；和其中所述环状RNA能够在受试者中产生先天免疫应答。20.权利要求19的方法，其中所述环状RNA不包含任何m6A。21.一种通过体外转录产生环状RNA分子的方法，所述方法包括：(a)提供编码所述环状RNA分子的DNA模板、核糖核苷三磷酸和RNA聚合酶；(c)从所述DNA模板转录线性RNA；和(d)使所述线性DNA环化，以形成环状RNA；其中所述核糖核苷三磷酸包含N6
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甲基腺苷
‑5’‑
三磷酸(m6ATP)；和其中与使用相同方法但不存在m6ATP的情况下产生的环状RNA相比，所述环状RNA是较低
免疫原性的。22.权利要求21的方法，其中所述重组环状RNA分子中至少1%的腺苷是N6
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甲基腺苷(m6A)。23.权利要求22的方法，其中所述重组环状RNA分子中至少10%的腺苷是N6
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甲基腺苷(m6A)。24.权利要求23的方法，其中所述重组环状RNA分子中的所有腺苷都是N6
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甲基腺苷(m6A)。25. 一种减少环状...

【专利技术属性】
技术研发人员：H，
申请(专利权)人：利兰，
类型：发明
国别省市：