驱动环状RNA翻译的遗传元件和使用方法技术

本文提供的是重组环状RNA(circRNA)分子，其包含可操作地连接到蛋白质编码核酸序列的内部核糖体进入位点(IRES)。IRES包括至少一个RNA二级结构元件；以及与18S核糖体RNA(rRNA)互补的序列区域。还提供的是使用重组circRNA分子在细胞中产生蛋白质的方法。分子在细胞中产生蛋白质的方法。分子在细胞中产生蛋白质的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】驱动环状RNA翻译的遗传元件和使用方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2021年5月10日提交的美国临时申请号63/186,507、以及于2020年6月25日提交的美国临时申请号63/043,964的优先权，所述美国临时申请的内容通过引用以其整体并入本文。
[0003]序列表
[0004]以电子方式随同提交的文本文件的内容通过引用以其整体并入本文：序列表的计算机可读格式副本(文件名：CRCB_003_02WO_SeqList_ST25.txt，创建日期：2021年6月24日，文件大小：约12.8兆字节)。


[0005]本专利技术涉及包含内部核糖体进入位点(IRES)的重组环状RNA(circRNA)分子以及其使用方法，所述内部核糖体进入位点含有RNA二级结构元件以及与18S rRNA互补的核酸序列区域。
[0006]关于联邦资助研究的声明
[0007]本专利技术在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的合同CA209919下由政府支持完成。政府在本专利技术中享有某些权利。

技术介绍

[0008]在过去十年中，来自深度测序和计算分析的结果已提示了，环状RNA(circRNA)是哺乳动物细胞中的一大类RNA，其在各种生物过程中起重要作用。已发现circRNA表达的破坏与人疾病相关，所述疾病例如阿尔茨海默病、糖尿病和癌症。此外，circRNA的特殊稳定性和细胞特异性表达模式已导致使用circRNA作为疾病如癌症的生物标记物、以及作为某些治疗的功效的指示剂。虽然大多数研究证实了circRNA充当非编码RNA，例如关于miRNA的海绵、mRNA剪接机制的调节剂、RNA结合蛋白(RBP)的隔离、RBP相互作用的调节剂和免疫应答的激活剂，但新出现的证据提示一些circRNA编码肽和/或蛋白质，并且从而通过这些编码的多肽发挥功能。已知由circRNA翻译的蛋白质调控细胞增殖、分化、迁移和肌生成。circRNA编码的蛋白质的失调已与某些癌症中的肿瘤发生相关。相应地，circRNA编码的蛋白质可能是生物学有关的circRNA类别与癌症以及可能的其它疾病之间的重要联系。因此，理解circRNA翻译的机制可能有助于利用circRNA生物学及其编码的蛋白质的治疗方法和/或形式的开发。
[0009]因为circRNA由剪接体介导的前体mRNA的头尾连接而生成，所以它不含通常已知为帽依赖性翻译所需的5'帽。因此，circRNA翻译利用替代机制来起始帽不依赖性翻译，例如使用由核糖体识别的内部核糖体进入位点(IRES)序列。在合成生成的circRNA上引入IRES足以起始编码的circRNA蛋白的翻译，从而提示了包含IRES序列的内源性circRNA在它们输出到细胞质时可能具有翻译潜力。
[0010]鉴于本领域的快速进展但仍处于初期的状态，仍然需要鉴定和表征除了IRES的存
在之外的遗传元件，其可以促进、起始、指导或调控circRNA翻译。特别地，需要鉴定新型IRES序列，其可以可操作地促进由circRNA编码的蛋白质的表达。

技术实现思路

[0011]本公开内容提供了编码一种或多种环状RNA(circRNA)分子的多核苷酸(例如，DNA序列)；其中所述环状RNA分子包含有效负荷序列区域(例如，蛋白质编码或非编码序列区域)、以及可操作地连接到有效负荷序列区域的内部核糖体进入位点(IRES)序列区域。在一些实施方案中，IRES包含：具有RNA二级结构元件的至少一个序列区域；以及与18S核糖体RNA(rRNA)互补的序列区域。在一些实施方案中，IRES具有小于
‑
18.9kJ/mol的最小自由能(MFE)和至少35.0℃的解链温度。本公开内容的一些实施方案包括其中RNA二级结构序列区域或元件由在IRES的约位置40至约位置60处的核苷酸形成的那些实施方案，其中在IRES的5'端处的第一个核苷酸被视为位置1。
[0012]本公开内容还提供了编码环状RNA分子的多核苷酸(例如，DNA序列)；其中所述环状RNA分子包含蛋白质编码核酸序列和内部核糖体进入位点(IRES)，其中所述IRES由以下编码：SEQ ID NO:1
‑
228或SEQ ID NO:229
‑
17201中的任何一个核酸序列、或者在至少50％的核酸序列长度上与其具有至少90％或至少95％同一性或同源性的核酸序列。
[0013]本公开内容还提供了重组环状RNA分子，其包含蛋白质编码核酸序列区域、以及可操作地连接到蛋白质编码核酸序列区域的内部核糖体进入位点(IRES)序列区域，其中所述IRES包含：具有二级结构元件的至少一个序列区域；以及与18S核糖体RNA(rRNA)互补的序列区域；其中所述IRES具有小于
‑
18.9kJ/mol的最小自由能(MFE)和至少35.0℃的解链温度。在一些实施方案中，蛋白质编码核酸序列区域以非天然构型可操作地连接到IRES。
[0014]本公开内容还提供了重组环状RNA分子，其包含蛋白质编码核酸序列区域、以及可操作地连接到蛋白质编码核酸序列的内部核糖体进入位点(IRES)序列区域；其中所述IRES由以下编码：SEQ ID NO:1
‑
228或SEQ ID NO:229
‑
17201中列出的任何一个核酸序列、或者与其具有至少90％或至少95％同源性或同一性的核酸序列。在一些实施方案中，蛋白质编码核酸序列区域以非天然构型可操作地连接到IRES。
[0015]还提供的是使用上述重组环状RNA分子或编码其的多核苷酸(例如，DNA分子)在细胞中产生蛋白质的方法。
[0016]还提供的是包含上述重组环状RNA分子或编码其的DNA分子的载体。
[0017]还提供的是包含上述重组环状RNA分子或编码其的DNA分子的宿主细胞。
[0018]还提供的是组合物，其包含(i)编码环状RNA的DNA序列、以及(ii)非编码环状RNA或编码其的DNA序列。
[0019]还提供的是用于将非编码环状RNA递送至细胞的方法，该方法包括使细胞与包含以下的组合物接触：编码环状RNA的DNA序列、以及(ii)非编码环状RNA或编码其的DNA序列，从而将非编码环状RNA递送至细胞。
[0020]本公开内容进一步提供了包含核酸序列区域的寡核苷酸，所述核酸序列区域与环状RNA分子上存在的内部核糖体进入位点(IRES)序列区域杂交，并且在杂交后抑制环状RNA分子的编码序列区域的翻译。还提供的是使用上述寡核苷酸抑制环状RNA分子的蛋白质编码核酸序列区域(例如有效负荷)翻译的方法。
[0021]这些及其它实施方案将在下文以及附图中更详细地解释。
附图说明
[0022]专利或申请文件含有至少一张彩色绘图。带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。
[0023]图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种编码环状RNA分子的多核苷酸序列；其中所述环状RNA分子包含蛋白质编码核酸序列区域、以及可操作地连接到蛋白质编码核酸序列的内部核糖体进入位点(IRES)序列区域，其中所述IRES序列区域包含：具有RNA二级结构元件的至少一个序列区域；以及与18S核糖体RNA(rRNA)互补的序列区域；其中所述IRES序列区域具有小于
‑
18.9kJ/mol的最小自由能(MFE)和至少35.0℃的解链温度；并且其中所述RNA二级结构元件由在IRES的约位置40至约位置60处的核苷酸形成，其中在所述IRES的5
’
端处的第一个核酸被视为位置1。2.权利要求1的多核苷酸序列，其中所述蛋白质编码核酸序列区域以非天然构型可操作地连接到IRES序列区域。3.权利要求1或2的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列是DNA序列。4.权利要求1
‑
3中任一项的多核苷酸序列，其中与18S rRNA互补的序列是SEQ ID NO:28977
‑
28983中的任何一个。5.权利要求1
‑
4中任一项的多核苷酸序列，其中所述至少一个RNA二级结构元件定位于与18S rRNA互补的序列区域的5'。6.权利要求1
‑
4中任一项的多核苷酸序列，其中所述至少一个RNA二级结构元件定位于与18S rRNA互补的序列区域的3'。7.权利要求1
‑
6中任一项的多核苷酸序列，其中所述至少一个RNA二级结构元件是茎环。8.权利要求1
‑
7中任一项的多核苷酸序列，其中所述至少一个RNA二级结构元件包含表2中列出的任何一个核酸序列。9.权利要求1
‑
8中任一项的多核苷酸序列，其中所述IRES序列区域的长度为约100至约1000个核苷酸。10.权利要求1
‑
8中任一项的多核苷酸序列，其中所述IRES序列区域的长度为约200至约800个核苷酸。11.权利要求1
‑
8中任一项的多核苷酸序列，其中所述IRES序列的长度为150
‑
200个核苷酸、160
‑
180个核苷酸、或200
‑
210个核苷酸。12.权利要求1
‑
11中任一项的多核苷酸序列，其包含至少一个非编码功能序列。13.权利要求12的多核苷酸序列，其中所述非编码功能序列包含一个或多个(a)微小RNA结合位点或(b)RNA结合蛋白结合位点。14.权利要求1
‑
11中任一项的多核苷酸序列，其中所述DNA序列包含适体。15.一种重组环状RNA分子，其由权利要求1
‑
14中任一项的多核苷酸序列编码。16.一种编码环状RNA分子的DNA序列；其中所述环状RNA分子包含蛋白质编码核酸序列区域、以及可操作地连接到蛋白质编码核酸序列的内部核糖体进入位点(IRES)序列区域；其中所述IRES序列区域包含SEQ ID NO:1
‑
228或SEQ ID NO:229
‑
17201中列出的任何一个核酸序列、或者与其具有至少90％或至少95％同一性或同源性的核酸序列。17.权利要求16的DNA序列，其中所述蛋白质编码核酸序列以非天然构型可操作地连接
到IRES序列区域。18.权利要求16
‑
17中任一项的DNA序列，其中所述IRES序列区域具有至少25％的G
‑
C含量。19.权利要求16
‑
18中任一项的DNA序列，其中所述IRES序列区域包含SEQ ID NO:1
‑
228中的任何一个核酸序列。20.权利要求16
‑
18中任一项的DNA序列，其中所述IRES序列区域包含SEQ ID NO:229
‑
17201中的任何一个核酸序列。21.权利要求16
‑
20中任一项的DNA序列，其中所述IRES序列区域包含SEQ ID NO:531、2270、2602、3042、3244和33948中任何一个的核酸序列。22.权利要求16
‑
21中任一项的DNA序列，其中所述IRES序列区域包含人IRES。23.权利要求16
‑
22中任一项的DNA序列，其中所述蛋白质编码核酸序列区域编码治疗性肽或蛋白质。24.权利要求16
‑
23中任一项的DNA序列，其中所述环状RNA分子包含约200个核苷酸至约10,000个核苷酸。25.权利要求13
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24中任一项的DNA序列，其中所述环状RNA分子包含在IRES序列区域和蛋白质编码核酸序列区域的起始密码子之间的间隔区。26.权利要求25的DNA序列，其中所述间隔区的长度经选择以相对于不具有间隔区或具有与所选间隔区不同的间隔区的环状RNA的翻译，增加蛋白质编码核酸序列区域的翻译。27.权利要求16
‑
26中任一项的DNA序列，其中所述IRES序列区域被配置为促进滚环翻译。28.权利要求16
‑
26中任一项的DNA序列，其中所述蛋白质编码核酸序列区域缺乏终止密码子。29.权利要求16
‑
26中任一项的DNA序列，其中(i)所述IRES序列区域被配置为促进滚环翻译，并且(ii)所述蛋白质编码核酸序列区域缺乏终止密码子。30.一种重组环状RNA分子，其由权利要求16
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29中任一项的DNA序列编码。31.一种病毒载体，其包含权利要求1
‑
14中任一项的多核苷酸或权利要求16
‑
29中任一项的DNA序列。32.权利要求31的病毒载体，其选自腺伴随病毒(AAV)载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、牛痘病毒和疱疹病毒载体。33.权利要求31或32的病毒载体，其中所述病毒载体是AAV。34.权利要求33的病毒载体，其中所述AAV血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAVrh10或其具有基本上相同的向性的任何变体。35.一种病毒样颗粒，其包含权利要求1
‑
14中任一项的多核苷酸或权利要求16
‑
29中任一项的DNA序列。36.一种非病毒样颗粒，其包含权利要求1
‑
14中任一项的多核苷酸或权利要求16
‑
29中任一项的DNA序列。37.一种闭合端DNA序列，其包含权利要求1
‑
14中任一项的多核苷酸或权利要求16
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29中任一项的DNA序列。38.一种质粒，其包含权利要求1
‑
14中任一项的多核苷酸或权利要求16
‑
29中任一项的
DNA序列。39.一种微型内含子质粒载体，其包含权利要求1
‑
14中任一项的多核苷酸或权利要求16
‑
29中任一项的DNA序列。40.一种组合物，其包含权利要求1
‑
14中任一项的多核苷酸、权利要求16
‑
29中任一项的DNA序列、或者权利要求15或30的重组环状RNA分子。41.权利要求40的组合物，其中所述脂质纳米颗粒是装饰的。42.一种宿主细胞，其包含权利要求1
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14中任一项的多核苷酸、权利要求16
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29中任一项的DNA序列、或者权利要求15或30的重组环状RNA分子。43.一种在细胞中产生蛋白质的方法，所述方法包括在由此环状RNA的蛋白质编码核酸序列被翻译并在细胞中产生蛋白质的条件下，使所述细胞与以下接触：(a)权利要求1
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14中任一项的多核苷酸，(b)权利要求16
‑
29中任一项的DNA序列，(c)权利要求15或30中任一项的环状RNA分子，(d)权利要求31
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34中任一项的病毒载体，(e)权利要求35的病毒样颗粒，(f)权利要求36的非病毒样颗粒，(g)权利要求37的闭合端DNA序列，(h)权利要求38的质粒，(i)权利要求39的微型内含子质粒载体，或(j)权利要求40
‑
41中任一项的组合物。44.权利要求43的方法，其中所述细胞中的5'帽依赖性翻译受损或不存在。45.权利要求43或44的方法，其中所述细胞是在体内的。46.权利要求45的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。47.权利要求46的方法，其中所述哺乳动物细胞衍生自人。48.权利要求45
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46中任一项的方法，其中所述蛋白质的产生是组织特异性的。49.权利要求48的方法，其中所述组织特异性定位于选自肌肉、肝、肾、脑、肺、皮肤、胰腺、血液和心脏的组织。50.权利要求43或44的方法，其中所述细胞是在体外的。51.权利要求43
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48中任一项的方法，其中所述蛋白质在细胞中递归表达。52.权利要求43
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51中任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：H，
申请(专利权)人：利兰，
类型：发明
国别省市：