点击修饰的mRNA制造技术

本发明专利技术涉及炔烃和/或叠氮化物修饰的mRNA、产生这种经修饰的mRNA的方法、经转染以包含经修饰的mRNA的细胞、包含经修饰的mRNA或包含经修饰的mRNA的细胞的药物组合物，以及此类mRNA、细胞或药物组合物在基于mRNA的治疗性和/或预防性应用中的用途。和/或预防性应用中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】点击修饰的mRNA
[0001]本专利技术涉及炔烃
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和/或叠氮化物
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修饰的mRNA、产生这种修饰的mRNA的方法、被转染以包含所述修饰的mRNA的细胞、包含修饰的mRNA或包含修饰的mRNA的细胞的药物组合物，以及这种mRNA、细胞或药物组合物在基于mRNA的治疗和/或预防应用中的用途。最后，本专利技术涉及通过引入炔烃
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和/或叠氮化物
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修饰的核苷酸来稳定RNA的方法和/或还涉及确定修饰的RNA向靶细胞的递送和/或由所述修饰的RNA编码的蛋白质产物的表达的方法。
[0002]专利技术背景
[0003]信使RNA(mRNA)是从细胞DNA转录而来并在生物体细胞中的核糖体上被翻译成氨基酸序列(即蛋白质)的模板分子。为了控制编码的蛋白质的表达水平，mRNA在含有编码氨基酸序列的遗传信息的实际开放阅读框架(ORF)两侧具有非翻译区(UTR)。此类非翻译区(称为5
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UTR和3
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UTR)分别是位于起始密码子之前和终止密码子之后的mRNA的片段。另外，mRNA含有poly(A)尾区，其为促进mRNA从细胞核中输出、翻译并在一定程度上保护mRNA免于降解的一段长腺嘌呤核苷酸序列。
[0004]由于其化学和生物化学性质，mRNA通常在细胞内几分钟内就降解了，因此特定蛋白质的表达通常是短暂的过程。此外，多聚阴离子mRNA分子不太适合穿过细胞膜，这使得mRNA的外部递送极其困难。
[0005]尽管存在这些与mRNA相关的挑战，但近年来的科技进步已经使mRNA成为新型药物种类的有希望的候选物。Sahin U.等，Nat.Publ.Gr.13，759
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780(2014)提供了关于基于mRNA的治疗剂和药物开发的概述。例如，如通过表达特定的表位或通过对结构性mRNA部分的先天免疫反应，mRNA被用于在体内触发蛋白质如抗体和酶的产生，或刺激免疫反应。例如，RIG
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1结合RNA的5
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三磷酸末端，并触发信号级联，所述信号级联作为抗病毒反应的一部分，导致转录因子的激活和细胞因子的释放。应用mRNA刺激免疫反应可用于治疗癌症、AIDS和产生针对几乎任何疾病的疫苗的新方法(参考Pardi，N.等，Nat.Publ.Gr.543，248
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251(2017)和Schlake T.等，RNA Biol.9，1319
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30(2012))。这些令人兴奋的发展的关键是稳定的具有提高的翻译效率的mRNA的强劲体外产生，以及使用特殊的转染制剂将其递送到细胞中。
[0006]mRNA的稳定性和翻译效率取决于几个因素。尤其地，mRNA两端的非翻译区起着至关重要的作用。在真核蛋白质表达中，5
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末端的帽结构和3
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末端的poly(A)尾都增强了mRNA的稳定性并提高了蛋白质表达。另外，5
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UTR含有翻译所必需的核糖体结合位点，3
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UTR含有采用二级结构的RNA序列，所述二级结构提高了稳定性并影响翻译。此外，还可掺入经修饰的天然(例如N1
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甲基假尿苷)和人工核苷酸，以提高mRNA的稳定性并且增强mRNA的翻译(Svitkin Y.V.等，Nucleic Acids Research，Vol.45，No.10，6023
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6036(2017))。
[0007]通过提供包含用于与细胞膜融合的脂质和中和寡核苷酸骨架负电荷的阳离子的混合物，可以实现将mRNA递送至细胞中。特殊的制剂已被开发出来优化mRNA的递送，并为临床试验提供足够的体内稳定性。大多数静脉施用的mRNA制剂被肝细胞吸收并在肝细胞内表达。这是由于肝脏在脂肪酸代谢中起主要作用，因此高脂质含量的mRNA制剂展示出器官特异性靶向作用。然而，在大多数情况下，肝脏不是期望的靶标，因此正在努力将脂质制剂改
性以靶向参与免疫反应的器官(例如脾脏)(Kranz L.M.等Nature 534，396
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401(2016))。或者，可从患者的血液中分离免疫系统的细胞(例如淋巴细胞)，并且离体进行mRNA的应用以允许靶向。最近，已公开了使用抗体片段修饰的脂质制剂进行的mRNA的组织特异性靶向(Moffett H.F.等，Nat.Commun.8，389(2017))。
[0008]尽管关于直接或间接(即通过细胞的离体转染并将这种转染的细胞返回给患者)的mRNA的治疗适用性有了最新进展和发展，进一步提高mRNA的稳定性和在它们用作治疗剂或药物的情况下开发新的选项是正在进行的研究的目标。此外，期望提供允许治疗性mRNA的流水线化高效产生的方法。另外，对于蛋白质替代和基因替代疗法，尤其是在遗传性疾病治疗的背景中，仍然需要先进的mRNA的靶向递送。还高度希望能够监控递送和蛋白质表达。最后，探索在例如癌症治疗中利用mRNA的免疫刺激作用的其它选项是正在进行的研究的另一个目标。

技术实现思路

[0009]本专利技术涉及为上述目的提供解决方案，并且尤其地涉及新的类型的mRNA修饰。这种修饰不仅能够稳定目标mRNA以用于离体应用和随后向人患者、动物或植物施用，而且能够容易地附接可检测的标记物或官能基，例如允许将经修饰的mRNA靶向递送至特定细胞或组织并监测这种递送。
[0010]在第一方面，本专利技术涉及包含5
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帽结构、5
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非翻译区(5
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UTR)、开放阅读框架区(ORF)、3
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非翻译区(3
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UTR)和poly(A)尾区的经修饰的mRNA，其中该mRNA在ORF、5
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UTR、3
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UTR和poly(A)尾区中的至少一个中的核苷酸中含有炔烃修饰或叠氮化物修饰中的至少一种。在本专利技术第一方面的特别优选的实施方案中，经修饰的mRNA包含一个或多个通过经修饰的mRNA与相应地修饰的含炔烃或叠氮化物的可检测标记物或功能性分子的点击反应引入的可检测的标记物和/或功能性分子。
[0011]在第二方面，本专利技术涉及产生根据本专利技术的经修饰的mRNA的方法，其中这种方法包括在RNA聚合酶和含有RNA转录所需核苷酸的核苷酸混合物存在的情况下，从DNA模板体外转录mRNA，其中核苷酸混合物中的至少一部分核苷酸被修饰成在核苷酸处含有炔烃或叠氮化物修饰。在该第二方面的可选实施方案中，经修饰的mRNA通过发酵过程产生。在这样的过程中，真核或原核细胞被转化为含有遗传信息(例如质粒)以产生所需的mRNA，并且炔烃或叠氮化物修饰的核苷、核苷酸或核苷酸前药被包含在生长培养基中。在该第二方面的另一个可选实施方案中，通过固相或亚磷酰胺合成来合成产生本专利技术的mRNA。
[0012]本专利技术的第三方面涉及用于制备本专利技术的位点特异性修饰的mRNA的酶促方法，该方法在mRNA的确定区域，例如仅在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种经修饰的mRNA(mRNA)，其包含5
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帽结构、5
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非翻译区(5
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UTR)、开放阅读框架区(ORF)、3
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非翻译区(3
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UTR)和poly(A)尾区，其特征在于其在所述ORF、所述5
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UTR、所述3
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UTR和所述poly(A)尾区中的至少一个中的至少一个核苷酸中含有炔烃或叠氮化物修饰的至少一种。2.根据权利要求1所述的经修饰的mRNA，其特征在于其在以下区域中合有经修饰的核苷酸a)所述ORF和所述UTR，b)所述ORF、所述UTR和所述poly(A)尾，或c)仅所述poly(A)尾。3.根据权利要求1或2所述的经修饰的mRNA，其中所述四种标准类型的核苷酸(AMP、CMP、GMP、UMP)中的至少一种被部分或完全修饰，优选在尿嘧啶或腺嘌呤处被乙炔基或叠氮基修饰。4.根据权利要求1至3中任一项所述的经修饰的mRNA，其中至少一个核苷酸是炔烃修饰的，并且至少一个核苷酸是叠氮化物修饰的。5.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的mRNA，其中所述四种标准类型的核苷酸中的至少一种以修饰形式与未修饰形式相比，以1∶100至10∶1，优选1∶10至1∶10或1∶1的比例存在。6.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的mRNA，其特征在于其另外含有经修饰的天然或人工核苷酸，优选假尿苷或N1
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甲基假尿苷。7.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的mRNA，其中所述经修饰的mRNA包含一种或多种可检测的标记物和功能性分子，所述可检测的标记物和功能性分子是通过所述经修饰的mRNA与相应地修饰的含炔烃或叠氮化物的可检测标记物或功能性分子的点击反应引入的。8.根据权利要求7所述的经修饰的mRNA，其中所述可检测的标记物是着色的或发荧光的分子和/或所述功能性分子是组织或细胞特异性靶向基团或配体，优选为糖部分或脂肪酸部分。9.一种经修饰的RNA，其中至少一个核苷酸中包含至少一个炔烃或叠氮化物修饰或包含根据权利要求1至8中任一项的经修饰的mRNA，所述经修饰的RNA与阳离子或聚阳离子化合物复合。10.一种方法，所述方法用于产生根据前述权利要求中任一项的经修饰的mRNA，其中所述方法包括从DNA模板体外转录mRNA，或者可选地使用原核或真核宿主细胞进行发酵过程以表达包含在表达载体中的DNA模板，其中所述过程在存在RNA聚合酶和包含进行mRNA转录所需的四种标准类型核苷酸的核苷酸混合物的情况下进行，在所述核苷酸混合物中，修饰所述四种类型核苷酸中的至少一种的至少一部分以包含炔烃或叠氮化物修饰。11.一种用于产生在poly(A)尾含有炔烃或叠氮化物修饰的经修饰的mRNA的方法，其中所述方法包括在ATP存在的情况下，在所述poly(A)尾上对mRNA进行poly(A)聚合酶加成反应，其中ATP在腺苷处至少部分被炔烃或叠氮化物修饰。12.根据权利要求10或11所述的方法，所述方法还包括在进行点击反应的条件下添加相应的炔烃或叠氮化物修饰的可检测的标记...

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：贝瑟克里科有限公司，
类型：发明
国别省市：