使用来自青鳉属的转座酶将核酸构建体整合入真核细胞制造技术

本发明专利技术提供了用于异源基因的高表达的多核苷酸载体。一些载体还包含进一步改善表达的新型转座子和转座酶。进一步公开了可在基因转移系统中使用，以将核酸稳定地引入细胞DNA中的载体。基因转移系统可以用于例如基因表达、生物加工、基因治疗、插入诱变，或基因发现等方法中。法中。法中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用来自青鳉属的转座酶将核酸构建体整合入真核细胞
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求于2019年4月8日提交的美国临时申请号62/831,092、2019年7月12日提交的美国临时申请号62/873,338，以及2020年2月27日提交的美国临时申请号62/982,186号的优先权；出于所有目的通过引用将每一篇的全部内容整体并入本文。对序列表的引用
[0002]本申请涉及名为546916SEQLST.TXT的txt文件中公开的序列，该文件创建于2020年4月6日，为2,254,295字节，通过引用并入。

技术介绍

[0003]整合到细胞基因组中的多核苷酸上编码的基因的表达水平取决于多核苷酸内序列元件的构型。整合的效率及从而整合到每个基因组中的多核苷酸的拷贝数，以及发生整合的基因组基因座也影响在多核苷酸上编码的基因的表达水平。通常可以通过将多核苷酸置于转座子中来提高多核苷酸整合到靶细胞基因组中的效率。
[0004]转座子包含被转座酶识别的两个末端。转座酶作用于转座子，以将其从一个DNA分子中去除，然后整合到另一个DNA分子中。两个转座子末端之间的DNA与转座子末端一起通过转座酶转座。本文的“合成转座子”指的是异源DNA，该异源DNA侧接一对转座子末端，以使其被转座酶识别并转座。将合成转座子和相应的转座酶引入真核细胞的细胞核中可能导致转座子转座到细胞的基因组中。这些结果是有用的，因为它们提高了转化效率，并且因为它们可以提高整合的异源DNA的表达水平。因此，本领域需要高活性转座酶和转座子。
[0005]通过piggyBac类转座酶的转座是完全可逆的。转座子最初整合在受体DNA分子中的整合靶序列上，在此过程中，靶序列在转座子反向末端重复序列(ITR)的每个末端处复制。随后的转座去除了转座子并使受体DNA恢复其先前的序列，即同时去除靶序列复本和转座子。但是，这不足以从已经整合了转座子的基因组中除去转座子，因为转座子很有可能从第一整合靶序列中切除而转座到基因组中的第二整合靶序列中。另一方面，缺乏整合(或转座)功能的转座酶可以从第一靶序列中切除转座子，但不能整合到第二靶序列中。因此，整合缺陷转座酶可用于逆转转座子的基因组整合。
[0006]转座酶的一种应用是用于工程真核基因组。这种工程可能需要将一个以上的不同多核苷酸整合到基因组中。这些整合可以是同时的或顺序的。当通过第一转座酶将包含第一异源多核苷酸的第一转座子转座入基因组之后是通过第二转座酶将包含第二异源多核苷酸的第二转座子转座入同一基因组时，有利的是第二转座酶不能识别并转座第一转座子。这是因为多核苷酸序列在基因组内的位置影响了在所述多核苷酸上编码的基因的可表达性，因此，第二转座酶将第一转座子转座到不同的染色体位置可以改变在第一异源多核苷酸上编码的任何基因的表达特性。因此，需要一组转座子及其相应的转座酶，其中该组中的转座酶仅识别和转座其相应的转座子，而不识别和转座该组中的任何其他转座子。
[0007]自1983年发现以来，来自尺蛾(looper moth)Trichoplusiani的piggyBac转座子和转座酶已被广泛用于将异源DNA插入来自许多不同生物的靶细胞的基因组中。piggyBac
系统是一种特别有价值的转座酶系统，因为：“其在广泛的生物体中具有活性，其能够高效整合多个大型转基因，其能够在不损失活性的情况下向转座酶中添加结构域，且从基因组中切除而不会留下足迹突变”(Doherty et al.,Hum.Gene Ther.23,311-320(2012),于p.312,LHC,2)。
[0008]piggyBac系统的价值和多功能性已经激发了巨大的、识别其它类似于piggyBac的活性转座子(通常称为piggyBac类元件，或PLE)的努力，但是这些努力在很大程度上没有成功。“由于piggyBac是用于转基因的最受欢迎的转座子之一，因此寻找新的活性PLE引起了很多关注。然而，迄今为止，仅报道了一些具有活性的PLE。”(Luo et al.,BMC Molecular Biology 15,28(2014)http://www.biomedcentral.com/1471-2199/15/28.12页中的第4页,RHC,1“Discussion”)。
[0009]尽管序列数据库中存在大量的piggyBac转座子和转座酶的同源物，但由于其大多数均被其宿主灭活以避免对宿主有害的活动，因此很少识别出具有活性的同源物；如以下摘录所述：“相关的piggyBac转座元件已在植物、真菌和动物(包括人类)中发现[125]，尽管它们可能由于突变而失活。”(Munoz-Lopez和Garcia-Perez，Current Genomics 11，115-128(2010)，于p.120，RHC，1)。“据信转座子会侵入基因组，然后在进化过程中遍及整个基因组。转座子的
‘
自私
’
的移动性对宿主有害；因此，它们通过自然选择被宿主消除或灭活。由于缺乏保守选择，甚至无害的转座子最终也会失去活性。因此，一般而言，转座子在宿主中的寿命很短，它们随后成为基因组中的化石。”(Hikosaka et al.,Mol.Biol.Evol.24,2648-3656(2007)于p.2648,LHC,1“Introduction”)。“基因组中转座元件的频繁移动是有害的”(Belancio et al.,2008；Deininger&Batzer,1999；Le Rouzic&Capy,2006；Oliver&Greene,2009)。结果，大多数转座元件在入侵新宿主后不久便被灭活。”(Luo et al.,Insect Science 18,652-662(2011)于p.660,LHC,1)。
[0010]已经发现三类piggyBac类元件：(1)与来自尺蛾的原始piggyBac非常相似的那些(在核苷酸水平上通常>95％相同)、(2)中等相关的那些(通常在氨基酸水平上30％-50％相同)，和(3)非常远地相关的那些(Wu et al.,Insect Science 15,521-528(2008)于p.521,RHC.2)。
[0011]与尺蛾转座酶高度相关的piggyBac类转座酶已经被几个研究小组描述。它们非常保守。在果蝇桔小实蝇(Bactrocera dorsalis)的三个不同品系中已报道了与原始的piggyBac非常相似的转座酶序列(95-98％核苷酸同一性)(Handler&McCombs，Insect Molecular Biology 9，605-612，(2000))。在其它桔小实蝇(Bactrocera)属中也发现了相对保守的piggyBac序列(Bonizzoni et al.,Insect Molecular Biology 16,645-650(2007))。两种夜蛾(谷实夜蛾(Helicoverpazea)和棉铃虫(He本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种多核苷酸，其包含编码转座酶的开放阅读框，所述转座酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：782至少90％相同，可操作地连接至异源启动子。2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述转座酶相对于SEQ ID NO：782的序列包含表1的C列和D列中所示的突变。3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其中所述转座酶相对于SEQ ID NO：782的序列在选自22、124、131、138、149、156、160、164、167、171、175、177、202、206、210、214、253、258、281、284、361、386、400、408、409、455、458、467、468、514、515、524、548、549、550和551的氨基酸位置处包含突变。4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述转座酶相对于SEQ ID NO：782包含选自以下的突变：E22D、A124C、Q131D、L138V、F149R、L156T、D160E、Y164F、I167L、A171T、R175K、K177N、T202R、I206L、I210L、N214D、V253I、V258L、I281F、A284L、L361I、V386I、M400L、S408E、L409I、F455Y、V458L、V467I、L468I、A514R、V515I、S524P、R548K、D549K、D550R和S551R，所述转座酶可选地包括选自选自所述组的至少2个、3个、4个，或5个。5.根据权利要求2所述的多核苷酸，其中所述转座酶的所述氨基酸序列选自SEQ ID NO：782或805-908。6.根据前述权利要求中任意一项所述的多核苷酸，其中所述转座酶可以从SEQ ID NO：41切除或转座转座子。7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中所述转座酶的切除活性或转座活性为SEQ ID NO：782的活性的至少10％。8.根据前述权利要求中任意一项所述的多核苷酸，其中所述启动子在体外转录反应中具有活性。9.根据权利要求1-7中任意一项所述的多核苷酸，其中所述启动子在真核细胞中具有活性。10.根据权利要求9所述的多核苷酸，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞，可选地，选择所述开放阅读框的密码子用于哺乳动物细胞表达。11.一种编码多肽的分离的mRNA，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：782至少90％相同，并且其中所述mRNA序列在所述mRNA和SEQ ID NO:781之间的相应位置处相对于...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰里米，
申请(专利权)人：DNA二零股份有限公司，
类型：发明
国别省市：