使用凋亡抗性细胞系产生多肽的方法技术

本文中提供包含人Bax和Bak基因中的每一者中的功能丧失突变的细胞系(例如HEK293细胞系)，以及包含所述细胞系的细胞培养物。所述细胞系和/或细胞培养物可用于例如产生重组多肽(诸如抗体或其抗原结合片段)或病毒载体的方法中。法中。法中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用凋亡抗性细胞系产生多肽的方法
[0001]相关申请案的交叉引用
[0002]本申请案主张2018年12月21日申请的美国临时申请案第62/784,051号的优先权权益，该案以引用的方式整体并入本文中。


[0003]本专利技术是关于产生重组多肽或病毒载体的方法，以及可用于例如所述方法中的细胞系和细胞培养物。

技术介绍

[0004]已确定单株抗体(mAb)和其他重组蛋白质为许多疾病适应症(包括免疫学、肿瘤学、神经科学和其他科学)的成功治疗剂(参见例如Reichert(2017)mAbs.9:167
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181；Singh等人,(2017)Curr.Clin.Pharmacol.13:85
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99)。由于生物技术行业中有超过300种mAb在开发中，故预计截至2020年，mAb市场将扩展至70种mAb产品(Ecker等人,(2015)mAbs.7:9
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14)。随着行业扩展和靶标变得更复杂，需要更大力度的抗体发现活动来筛检多个mAb变异体并鉴定具有所需特征的临床候选物。
[0005]使用阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)对哺乳动物细胞进行瞬时转染已成为快速产生供大分子开发(包括抗体发现筛检研究)用的重组蛋白质的盛行方法(Baldi等人,(2007)Biotechnol.Lett.29:677
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684；Hacker等人,(2013)Protein Expr.Purif.92:67
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76；Stuible等人,(2018)J.Biotechnol.281:39
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47；Longo等人,(2013)Meth.Enzymol.529:227
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240；Rajendra等人,(2015)Biotechnol.Prog.31:541
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549)。人类胎肾293(HEK293)和中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞通常用于瞬时转染，这是因为其高度可转染且其转染过程可规模化。
[0006]尽管HEK293产物质量与来自CHO细胞的产物质量相比可能有所不同(Ding等人,(2017)Appl.Microbiol.Biotechnol.101:1889
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1898)，但与CHO相比，HEK293转染可在一半时间内产生更高效价(Delafosse等人,(2016)J.Biotechnol.227:103
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111；Chiou等人,(2014)Scalable transient protein expression.编.Animal cell biotechnology:Methods and protocols.Totowa,NJ:Humana Press.第35
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55页)，且非常顺应于高通量自动化小规模转染(Vink等人,(2014)Methods 65:5
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10；Bos等人,(2014)J.Biotechnol.180:10
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16；Zhao等人,(2011)J.Struct.Biol.175:209
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215；Girard等人,(2001)Biochem.Eng.J.7:117
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119；Raymond等人,(2011)Methods 55:44
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51；Nettelship等人,(2010)J.Struct.Biol.172:55
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65)。尽管有众多报告描述CHO大规模生物反应器培养和转染，但对HEK293细胞的发现却很少，且目前并无在生物反应器中长期培养HEK293种子培养物以支持常规高通量转染从而产生大量蛋白质的报告。
[0007]本文中引用的所有参考文献，包括专利申请案、专利公开案和UniProtKB/Swiss
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Prot登录号，皆以引用的方式整体并入本文中，如同明确地且单独地指示各单独参考文献是以引用的方式并入。

技术实现思路

[0008]仍需要用于培养人类细胞系(诸如HEK293来源的细胞系)，以便产生重组多核苷酸和/或多肽的最佳方法。特别地，已发现HEK293细胞当在生物反应器中培养时对剪切应力敏感且具有低存活率；也报告旋转烧瓶(Mohd Zin等人,(2016)Fluid Mechanics:Open Access 3:1
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5)和中空纤维过滤器(Rockberg等人,(2018)Production of biopharmaceuticals in an intensified perfusion process of HEK 293 cells.论文发表于：Cell Culture Engineering XVI.Tampa,Florida,USA)中HEK293培养物对剪切应力的敏感性。因而，需要对细胞凋亡具有抗性，以便在生物反应器中提供更高生产率和更稳定效能的HEK293细胞系。
[0009]为了满足这些和其他需求，本文中提供包含人Bax和Bak基因中的每一者中的功能丧失突变的HEK293细胞系。有利地，这些细胞系和其培养物可用于产生重组多核苷酸和/或多肽产物，包括但不限于抗体(或抗原结合抗体片段)、抗原、酶、疫苗和病毒载体。
[0010]在一方面，本文中提供产生重组多肽的方法，该方法包括在适合产生该多肽的条件下培养HEK293细胞系，该细胞系包含(a)人Bax和Bak基因中的每一者中的功能丧失突变和(b)编码该重组多肽的多核苷酸。在一些实施例中，编码该重组多肽的多核苷酸为染色体外多核苷酸。在一些实施例中，编码该重组多肽的多核苷酸被整合至HEK293细胞系的染色体中。在一些实施例中，该重组多肽为抗体或其抗原结合片段、抗原、酶或疫苗。在一些实施例中，该重组多肽为抗体或其抗原结合片段(例如，诊断或治疗抗体或其抗原结合片段)。在一些实施例中，该细胞系在7天内以约650mg/L的效价产生重组多肽。在一些实施例中，该方法进一步包括自该细胞系分离重组多肽。
[0011]在另一方面，本文中提供产生病毒载体的方法，该方法包括在适合产生该病毒载体的条件下培养HEK293细胞系，该细胞系包含(a)人Bax和Bak基因中的每一者中的功能丧失突变；(b)病毒基因组；及(c)一种或多种编码病毒衣壳的多核苷酸。在一些实施例中，该方法进一步包括自该细胞系分离病毒载体。
[0012]在以上实施例中任一个的一些实施例中，在细胞培养基中培养细胞系。在一些实施例中，在介于约6.7与约7.3之间、介于约6.9与约7.1之间、介于约6.95与约7.05之间或在约7.0的pH培养该细胞系。在一些实施例中，在约30％的溶解氧(DO)设定点培养该细胞系。在一些实施例中，在施加约13W/m3的功率输入/体积(P/V)的搅拌速率下培养该细胞系。在一些实施例中，以至少约10L的体积培养该细胞系。在一些实施例中，以至少约25L的体积培养该细胞系。在一些实施例中，在35L生物反应器本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生重组多肽的方法，其包括：在适合产生所述多肽的条件下培养HEK293细胞系，所述HEK293细胞系包含(a)人Bax和Bak基因中的每一者中的功能丧失突变以及(b)编码所述重组多肽的多核苷酸。2.根据权利要求1所述的方法，其中编码所述重组多肽的所述多核苷酸为染色体外多核苷酸。3.根据权利要求1所述的方法，其中编码所述重组多肽的所述多核苷酸被整合至所述HEK293细胞系的染色体中。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述重组多肽为抗体或其抗原结合片段、抗原、酶或疫苗。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述重组多肽为抗体或其抗原结合片段。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述细胞系在7天内以约650mg/L的效价产生所述重组多肽。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其进一步包括从所述细胞系分离所述重组多肽。8.一种产生病毒载体的方法，其包括：在适合产生所述病毒载体的条件下培养HEK293细胞系，所述HEK293细胞系包含(a)人Bax和Bak基因中的每一者中的功能丧失突变；(b)病毒基因组；以及(c)一种或多种编码病毒衣壳的多核苷酸。9.根据权利要求8所述的方法，其进一步包括从所述细胞系分离所述病毒载体。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中在细胞培养基中培养所述细胞系。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中在介于约6.7与约7.3之间的pH培养所述细胞系。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中在约30％的溶解氧(DO)设定点培养所述细胞系。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中在赋予约13W/m3的功率输入/体积(P/V)的搅拌速率培养所述细胞系。14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中以至少约10L的体积培养所述细胞系。15.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中以至少约25L的体积培养所述细胞系。16.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中在35L生物反应器培养物中培养所述细胞系。17.根据权利要求16所述的方法，其包括在35L生物反应器培养物中培养所述细胞系60天。18.根据权利要求17所述的方法，其中在35L生物反应器培养物中培养所述细胞系60天之后，所述细胞系维持至少85％细胞存活率。19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中在所述35L生物反应器培养物中以介于约20L与约35L之间的工作体积培养所述细胞系。20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中在分批饲喂培养条件下培养所述细
胞系。21.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中在灌流培养条件下培养所述细胞系。22.一种细胞培养物，其包含细胞培养基和多个HEK293细胞，其中所述多个细胞中的每个细胞包含人Bax和Bak基因中的每一者中的功能丧失突变。23.根据权利要求22所述的细胞培养物，其中所述细胞处于足以用于35L生物反应器培养物的细胞密度。24.根据权利要求23所述的细胞培养物，其中所述细胞在足以用于35L生物反应器培养物的细胞密度维持60天。25.根据权利要求24所述的细胞培养物，其中在35L生物反应器培养物中培养所述细胞系60天之后，所述细胞系维持至少85...

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：豪夫迈，
类型：发明
国别省市：