一种Bst-LF聚合酶酶活测定方法技术

本发明专利技术公开了一种Bst

【技术实现步骤摘要】
一种Bst
‑
LF聚合酶酶活测定方法


[0001]本专利技术涉及DNA聚合酶
，具体为Bst
‑
LF聚合酶的酶活检测方法。

技术介绍

[0002]Bst DNA聚合酶大片段是将缺少5'
→
3'外切核酸酶结构域的Bacillusstearothermophilus(嗜热脂肪芽孢杆菌)DNA聚合酶基因在E.coli中表达纯化而得，它具有下列特点：
[0003]1.5
′→3′
DNA聚合酶活性，但不具有5
′→3′
外切核酸酶活性，因此没有纠错功能。
[0004]2.嗜温性，最适反应温度为68℃，建议反应温度不要超过70℃。
[0005]3.强链置换能力，可以用于DNA链置换反应和LAMP扩增。还可用于68cDNA测序(该条件尤其适用于富含GC的模板和纳克级的模板)。
[0006]4.不能用于热循环测序或PCR，80℃10分钟即可失活。
[0007]目前测定DNA聚合酶活力的方法主要有：
[0008]1、同位素标记法，利用同位素3H标记的dNTP，把30分钟内在最适反应温度下将10nmol dNTP掺入酸不溶物所需的酶量定义为1个活力单位(U)，该方法最为准确，也是国内外主流厂商约定俗成的DNA聚合酶活力定义标准。但受限于同位素操作资质与放射性防护条件，很难在普通实验室实现。
[0009]2、琼脂糖凝胶电泳或荧光定量PCR法，使用已标定酶活的对照品与样品扩增同样的模板，通过比较产物凝胶电泳条带亮度或荧光定量PCR的Ct值来计算样品活性相对于对照品的倍数。这两种方法只能实现相对定量，耗时长，且受对照品批次间活力标定不稳定因素影响较大，重复性差，灵敏度低。
[0010]3、此外，还有其他一些利用荧光标记探针的方法，但探针设计复杂，荧光标记价格昂贵，且标记基团可能会影响聚合酶活性，也未能得到广泛应用。
[0011]目前Bst聚合酶没有其特异的方法对它进行酶活性检测，本专利技术设计一种专门检测Bst聚合酶活性的方法，使Bst聚合酶的活性检测更加精准，操作更简单。

技术实现思路

[0012]基于上述情况，我们公开了一种Bst
‑
LF聚合酶酶活测定方法，解决上述技术问题。
[0013]本专利技术采用荧光定量PCR进行Bst
‑
LF聚合酶的酶活测定，是一种耗时短、操作简单、且重复性好的绝对定量方法。
[0014]为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：
[0015]一种Bst
‑
LF聚合酶酶活测定方法，包括以下步骤；
[0016](1)设计DNA模板，在DNA模板一端标记切刻内切酶识别位点GAG T C NNNN
▼
N；
[0017](2)建立Bst
‑
LF聚合酶酶活测定体系和反应条件；
[0018](3)利用DNA标准品进行梯度稀释且用Oligreen染料预染，测试每个梯度的荧光值，建立标准曲线，从而推断Bst聚合酶的酶活。
[0019]优选的，所述DNA模板为；λDNA；
[0020]所述切刻内切酶为：BstNBI
[0021]所述Bst
‑
LF聚合酶酶活测定体系包括如下组分：
[0022]组分终浓度超纯水\10
×
Thermo pol反应缓冲液25xdNTP混合液5mMBstNBI1UλDNA800ng/ulOligreen200
×
[0023]所述Thermo pol反应缓冲液具体成分如下，
[0024][0025]所述反应条件为：65℃等温反应10min。
[0026]优选的，所述Bst
‑
LF聚合酶酶活测定体系与所述待测酶的混合比例为：5:1。
[0027]优选的，所述Bst
‑
LF聚合酶的酶活定义为：65℃条件下，10min内产生3595.5ngDNA时，所需要的酶量定义为1个活性单位(U)；
[0028]根据待测酶的荧光值y2结合所述DNA标准品建立的标准曲线y＝kx+b计算出DNA的量，
[0029]根据所述Bst
‑
LF聚合酶的酶活定义与DNA的量的一一对应关系，得出所述待测酶的酶活值S＝(y2
‑
b)/k/3595.5。
[0030]本专利技术的技术原理如下：
[0031]设计DNA模板，在DNA模板一端标记切刻内切酶识别位点G A G T C N NN N
▼
N；
[0032]切刻内切酶使DNA双链产生缺口；
[0033]Bst聚合酶稀释4个梯度进行链置换反应，置换出一条单链，单链DNA与Oligreen染料结合产生荧光；
[0034]DNA标准品进行梯度稀释且用染料预染，测试每个梯度的荧光值，建立标准曲线，推断Bst聚合酶的酶活。
[0035]染料简介
[0036]Oligreen染料特异性结合单链核酸，与双链核酸不结合。
[0037]刻限制性内切酶(BstNBI)
[0038]BstNBI是一种切刻内切酶，特异性切割双链DNA底物上的其中一条链。识别位点为5'
…
G A G T C N N N N
▼
N
…
3'3'
…
C T C A G N N N N N
…
5'N＝A、C、G或T
[0039]链置换
[0040]链置换扩增术(strand displacement amplification,SDA)是近几年发展起来的一种酶促DNA体外等温扩增方法。在靶DNA两端带上被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列，核酸内切酶在其识别位点将链DNA打开缺口，DNA聚合酶继之延伸缺口3'端并替换下一条DNA链。
[0041]与现有技术相比，本专利技术所达到的有益效果是：本专利技术的测定方法，耗时短、重复性好、操作简单。
附图说明
[0042]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：
[0043]图1是实例一的荧光信号图；
[0044]图2是实例一的标准曲线图；
[0045]图3是实例二的荧光图谱；
[0046]图4是实例二的标准曲线图；
[0047]图5是实例四的第一次试验图；
[0048]图6是实例四的第二次试验图；
[0049]图7是实例四的第三次试验图。
具体实施方式
[0050]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Bst
‑
LF聚合酶酶活测定方法，其特征在于，包括以下步骤；(1)设计DNA模板，在DNA模板一端标记切刻内切酶识别位点G A G T C N N N N
▼
N；(2)建立Bst
‑
LF聚合酶酶活测定体系和反应条件；(3)利用DNA标准品进行梯度稀释且用Oligreen染料预染，测试每个梯度的荧光值，建立标准曲线，从而推断Bst聚合酶的酶活。2.根据权利要求1所述的一种Bst
‑
LF聚合酶酶活测定方法，其特征在于，所述DNA模板为；λDNA；所述切刻内切酶为：BstNBI所述Bst
‑
LF聚合酶酶活测定体系包括如下组分：组分终浓度超纯水\10
×
Thermo pol反应缓冲液25xdNTP混合液5mMBstNBI1UλDNA800ng/ulOligreen200

【专利技术属性】
技术研发人员：赵春艳，张惠丹，
申请(专利权)人：苏州绘真生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：