用于检测人体液中的HLA-B27基因的RAA引物、CrRNA、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供了用于检测人体液中的HLA

【技术实现步骤摘要】
用于检测人体液中的HLA
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B27基因的RAA引物、CrRNA、试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及用于检测人体液中的HLA
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B27基因的RAA引物、CrRNA、试剂盒及RAA
‑
CRISPR
‑
Cas13a检测方法。

技术介绍

[0002]强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)是一种慢性自身免疫性疾病，主要侵犯脊柱和骶骨关节，严重时可造成脊柱畸形和关节强直。该病在世界各地的发病率在0.25％～0.45％之间，我国约为0.26％，及早确诊并进行干预治疗，可以有效延缓该疾病进展。AS的确诊需要明确的骶髂关节炎症状和影像学异常病变提示，但临床症状和影像学分析一般滞后5
‑
7年，可能导致患者错过最佳治疗时机。
[0003]1973年Brewerton等人首先提出人类白细胞抗原B27(Human leukocyte antigen B27，HLA
‑
B27)与AS具有很强的相关性，随后大量不同人群和地区的流行病学调查证实了这一结论。AS患者HLA
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B27阳性率高达90％左右，正常人阳性率仅为4％～7％。HLA
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B27阳性人群AS发病率约为10％～20％，而阴性人群发病仅为1
‰
～2
‰
。因此，HLA
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B27检测结果对于AS，尤其是只有轻微关节疼痛没有典型影像特征的AS早期具有很高的辅助诊断价值。
[0004]目前，流式细胞分析法最常用于临床HLA
‑
B27的检测，具有自动化程度高，检测耗时短的优点，缺点是需要新鲜的样本，少数情况可能因抗体交叉反应和病原感染产生错误结果。其次是荧光PCR法，具有样本新鲜程度要求低，使用量少，有利于集中检测和重复检测的优点，缺点是需要提取DNA，检测耗时较长。但流式细胞分析法和荧光PCR法设备均较昂贵，维护成本高，结果判断不够直观，不太适合在病人较少，经济条件较差、专业技术人员缺乏的基层医疗单位使用。
[0005]重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)结合规律间隔性成簇短回文重复序列及其相关蛋白13a(CRISPR
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Cas13a)检测系统只需简单的恒温装置，结果可通过便携式荧光检测装置或试纸条直观获得，适合基层医疗单位使用。CRISPR
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Cas13a属于第二大类的CRISPR
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Cas系统，Cas13a具有RNA介导的RNA旁系切割活性,该蛋白的PFS(Protos pacer Flanking Site)为A、C和U，不宜为G，其激活仅需要CrRNA无需反式作用CRISPR RNA(trans
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acting CRISPR RNA,tracrRNA)，通过添加荧光
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猝灭基团、地高辛—生物素等修饰的RNA，可以实现序列信息向荧光或纳米金试纸条可见信号的转化。RAA与CRISPR
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Cas 13a结合使用，特异性和灵敏度较两者单独使用显著提高，尤其是灵敏度，达到埃摩尔级别。
[0006]现有技术中，虽然已有将RAA与CRISPR
‑
Cas13a检测系统相结合用于检测某些样的报道，但其检测背景中不含高度相似的序列，引物和CrRNA的设计相对简单，特异性也比较好。如检测新型冠状病毒(如中国专利申请CN202010898296.9，用于高效检测新型冠状病毒的RAA
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CRISPR扩增引物组、试剂盒及方法)等，但H LA
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B族基因却具有特殊性，简单的套用现有专利技术可能面对如下技术问题：
[0007]一是假阳性过高的技术问题，除B27基因外，HLA
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B基因座还可能是B7:02,42:01,
54:01,55:02,08:01和58:01等高度相似的基因，需要同时识别多个标志性碱基的才能检出HLA
‑
B27基因，在不使用Blockers，PNA，内参，PDRA，以及引物3
’
末端不添加额外错配的情况下，RAA对错配碱基比较包容，容易产生非特异性扩增；
[0008]二是基层医疗单位适用性下降的问题：若以CRISPR
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Cas13a保证B27检测特异性，由于单条CrRNA同时检测多个特定碱基的方法尚不明确，需要针对多个B27标志性碱基设计多个CrRN A进行多管检测或单管检测，多管检测，操作繁琐。单管检测，即同一管中包括多种Cas蛋白(如：PsmCas13b，Cca13b，Lwa Cas13a等)，多种CrRNA和多种报告RNA，利用Cas蛋白不同的旁系切割序列的偏好性实现多个标志性碱基的同时检测，但由于不同Cas13蛋白的旁系切割碱基序列的偏好性并不是绝对的，单管检测结果较难判断。

技术实现思路

[0009]为了克服现有技术中存在的技术问题，本专利技术的目的是提供用于检测人体液中的HLA
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B27基因的RAA引物、CrRNA、试剂盒及RAA
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CRISPR
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Cas13a检测方法，以便应用RAA
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CRISPR
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Cas13a检测系统特异性检测人体液中的HLA
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B27基因。
[0010]为实现上述目的，本专利技术的专利技术人利用IMGT/HLA数据库对比全部HLA
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B等位基因序列，选取HLA
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B族基因之间差异较大的外显子2cDNA第139
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342处(IMGT/HLA，HLA
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B27:04:01，Accession Number:HLA00226为例)作为扩增区域，在此范围内设计RAA引物和CrRNA，扩增区域序列如SEQ ID NO.1所示，
[0011]SEQ ID NO.1：
[0012]HLA
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B27:04:01ATCACCGTGGGCTACGTGGACGACACGCTGTTCGTGAGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGTCCGAGAGAGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCGGGAGACACAGATCTGCAAGGCCAAGGCACAGACTGACCGAGAGAGCCTGCGGACCCTGCTCCGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCG
[0013]本专利技术的第一个目的是提供用于检测人体液中的HLA
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B27基因的RAA引物对和CrRNA的组合。
[0014]所述RAA引物对包括正向引物和反向引物，其中正向引物序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物序列如SEQ ID NO.3所示：
[0015]SEQ ID NO.2，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测人体液中的HLA
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B27基因的RAA引物对和CrRNA的组合，其特征在于，所述的RAA引物对包括如SEQ ID NO.2所示序列的正向引物和如SEQ ID NO.3所示序列的反向引物：其中正向引物的5'末端具有T7 RNA聚合酶启动子序列，其序列如SEQ ID NO.20所示；所述的CrRNA的序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示；CrRNA组成为5
’‑
锚定序列
‑
间隔序列
‑3’
，锚定序列与Cas13a蛋白对应，间隔序列与靶序列片段特异性结合；CrRNA的靶序列如SEQ ID NO.4所示；序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的CrRNA的3'末端的间隔序列如SEQ ID NO.21所示。2.一种检测人体液中的HLA
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B27基因的试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1所述RAA引物对和CrRNA的组...

【专利技术属性】
技术研发人员：茅光耀，伏小阳，叶军，
申请(专利权)人：泰州市人民医院，
类型：发明
国别省市：