一种单细胞转录组体外扩增方法技术

本发明专利技术公开了一种单细胞转录组体外扩增方法。包括如下步骤：首先将单个细胞放入细胞裂解液中，反转录合成第一链cDNA；合成第二链cDNA，在新生成的双链cDNA的两条链的5

【技术实现步骤摘要】
一种单细胞转录组体外扩增方法
[0001]本专利技术要求优先权日为2020年12月29日、申请号为202011603442.7的中国专利申请的优先权。


[0002]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种单细胞转录组体外扩增方法。

技术介绍

[0003]转录组分析是一个将细胞基因型和表型联系起来的强有力的策略。生物体的发育是由基因的转录以及mRNA转译为蛋白这一过程的时间和空间的变化所驱使和调控的。基本上，一个个体生物的所有细胞都有一个几乎相同的基因型，而个体的转录组则反映着表达的那部分基因，这些基因的表达是由其表观遗传状态所决定的。不同类型的细胞有着不同的转录组，这一特点可以用来推断多细胞生物发育过程中，基于其生理功能、行为和表型的基因调控网络。正是因为不同的细胞有着不同的转录组，所以转录组的分析应该在单个细胞的水平上进行。这样的分析应该包括RNA的精确序列、数量、位置、活性(比如是转译还是被降解)和所有类型完整长度的RNA在单个碱基水平上的修饰(比如甲基化)。实际上，在mRNA、rRNA、tRNA以及小的核RNA的数千个不同的位置中存在着100多种不同结构的转录后修饰。因为技术的限制，对于转录组的研究曾一度停留在十万甚至百万细胞的水平上。可是在某些情况下，比如早期胚胎，并没有大量的细胞可供对其转录组进行研究。
[0004]单细胞转录组分析可以在全基因组的水平上确定基因调控网络，也可以通过与感兴趣基因的过表达，敲除或者敲减相结合来揭示目标细胞中该基因是如何调控其他基因表达的。对于干细胞以及早期胚胎细胞的分析，由于其细胞亚群的高度动态性和异质性，单细胞转录组分析显得尤为重要。对细胞间的异质性的分析是作为单细胞转录组的一个重要应用而发展起来的。即使高度相似的细胞类型，它们的基因表达谱也会因不同的原因而完全不同。更为重要的是，因为微环境或者参与转录和转译的少量的分子的不同，基因的表达本质上是随机的。可以很确定的说，基因表达的异质性是活细胞的天生特性，一个组织器官中没有完全一样的两个细胞。此外，基因表达的随机性可以极大程度的影响细胞的命运和表型。因此，对同一细胞类型的基因表达异质性的研究是单细胞分析的一个重要方面。事实上目前已有证据表明，胚胎干细胞的亚群细胞中Nanog，Rex1或者Stella等基因的表达具有异质性。肿瘤中细胞的异质性很早就被发现了，而单细胞转录组分析使得对肿瘤中细胞亚群的鉴定和对可能的癌症干细胞的检测变得具有可行性。此外，因为这样的分析只需要一个从组织中分离出一个细胞，理论上来说，对基因表达网络的分析可以无创性地扫描人体疾病的发展过程，可以扫描比较稀有珍贵的生物样本以及连续的追踪一个组织在生理或者病理过程中基因表达的动态性。单细胞转录组分析的另外一个应用是确定亚细胞的基因表达谱。例如，现在已知的，神经细胞局部转译过程中，mRNA会从细胞体转运到轴突或树突中。单细胞转录组分析则可以用于对轴突或树突中mRNA的特异性定位检测。
[0005]由于二代测序技术可以提供单个碱基水平上的信息，所以在单细胞中也可通过区
别两个等位基因的单核苷酸多态性，来分析等位基因的特异性基因表达。这将极大的提高我们对于遗传和表观遗传因子在单个细胞中是通过什么方式影响等位基因特异性基因表达的理解。等位基因失衡可以准确的描述由于突变(比如点突变或者RNA编辑)而引起的相关等位基因特异性表达的变化所造成的细胞间多种微小的不同。
[0006]一个细胞里，RNA的量仅仅处在皮克级的水平，如此微量的RNA，现阶段无论是对于芯片实验还是测序仪器都很难达到最低上样需求，因此进行单细胞转录组研究必须先对单细胞内的微量核酸分子进行扩增，而且必须保证尽可能少地出现技术误差，以便开展后续的测序及其他研究。
[0007]目前单细胞RNA体外扩增的方法主要分为以下几种：一种是Brady等人的基于PCR的指数扩增法，另一种是Van Gelder等人和Eberwine等人的基于体外转录的线性扩增法。除此之外，Kurimoto等人将这两种方法结合起来提出一种改进的全局单细胞cDNA体外扩增法。
[0008]Eberwine的线性扩增法首先用一个含有T7 RNA聚合酶启动子序列的寡聚dT引物对mRNA进行反转录，再将mRNA
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cDNA杂种分子用RNase H处理，然后用被分解了的RNA片段作为引物合成cDNA第二条链，接着用T7 RNA聚合酶进行体外转录，合成反义RNA(anti
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sense RNA,aRNA)，从而达到扩增RNA的目的。目前又有一些研究人员对这一方法的各项条件进行了优化。
[0009]由于该方法利用了寡聚dT引物来合成cDNA的第一条链，所以扩增出的aRNA的5
’
端是无法保证的，因此，扩增出的aRNA的长度都比最初的mRNA短。为了能够获得全长的aRNA,Wang将上述的Eberwine法进行了改进。该改进方法基于以下发现：某些反转录酶具有内源的末端转移酶活性，在反转录到mRNA5
’
端的帽子结构时，会在合成的第一链cDNA的3
’
端额外加上几个C，如果此时有3
’
末端含有几个G的引物存在，就会与上述突出的C配对退火，反转录酶就将模板从mRNA转换到引物序列，直至完全合成，该技术也称为SMART技术。利用该技术结合Eberwine法，就可以体外转录合成出全长的aRNA，这也是该方法的最大优点。这些方法都是利用含有T7 RNA聚合酶启动子序列的寡聚dT引物来合成cDNA第一条链，因此在进行体外转录进行扩增时其产物都是aRNA，为了获得有义RNA(sense RNA,sRNA)，Rajeevan等人用寡聚dT为引物合成cDNA第一条链，将SMART技术中的5
’
端引物进行修饰，增加了SP6噬菌体的RNA聚合酶启动子序列，合成的双链cDNA经PCR扩增之后，然后进行体外转录扩增，由于引入的启动子序列在5
’
端，所以扩增出的是sRNA。而Kaposi
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Novak等人则利用Eberwine法进行一轮扩增之后，将含有T3噬菌体启动子序列及9个随机核苷酸的引物引入5
’
端，以aRNA为模板合成cDNA的第一条链，然后合成cDNA的第二条链，最后用T3 RNA聚合酶(MEGAscript T3 Kit)体外转录合成sRNA。
[0010]2004年，Che和Ginsberg提出了一种称为末端延伸(terminal continuation,TC)的新的RNA扩增方法则与上述方法的原理不尽相同。该方法采用了一条含有噬菌体RNA聚合酶启动子的引物，引物的3
’
端是3个连续的C碱基，其可能的扩增原理是利用哺乳动物基因5
’
端的CpG岛，当以寡聚dT引物合成cDNA第一条链时，TC引物的3
’
端与位于基因5
’
区的CpG岛复性，当合成至此时反转录酶转换为以TC引物为模板继续合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单细胞转录组体外扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将单个细胞放入细胞裂解液中，反转录合成第一链cDNA；(2)合成第二链cDNA，在新生成的双链cDNA的两条链的5
’
端分别加上T3或SP6和T7 RNA聚合酶启动子序列；(3)分别用与所加启动子相对应的T3或SP6和T7 RNA聚合酶进行体外转录，做线性扩增；(4)扩增所得RNA分别用对应的引物进行反转录，得到单链cDNA，单链cDNA混合后，互补的cDNA相互结合，自动合成双链cDNA。2.根据权利要求1所述单细胞转录组体外扩增方法，其特征在于，步骤(4)得到的双链cDNA用于下游的PCR扩增，或者用于体外转录线性扩增。3.根据权利要求1所述单细胞转录组体外扩增方法，其特征在于，步骤(4)得到的双链cDNA可以用于芯片实验，二代测序或者RT
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PCR。4.根据权利要求1所述单细胞转录组体...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾凡一，王云杰，马晴雯，黄淑帧，
申请(专利权)人：上海凡翼生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：