一种一步法检测MET基因14号外显子跳跃突变的方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及生物制品技术领域，公开了一种一步法检测MET基因14号外显子跳跃突变的方法，包括以下步骤：步骤一：采用特异的MET基因上游引物(跨13号外显子和15号外显子，并人为引物碱基突变)、下游引物(位于15号外显子上)和探针(位于15号外显子上)，以及内参基因(GAPDH基因)特异性引物探针；步骤二：结合一步法RT

【技术实现步骤摘要】
一种一步法检测MET基因14号外显子跳跃突变的方法和试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物制品
，具体为一种一步法检测MET基因14号外显子跳跃突变的方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]MET也称为c
‑
MET，为原癌基因，位于人类7号染色体长臂(7q31)，基因大小约110kb，包括21个外显子。MET是受体酪氨酸激酶家族的成员之一,具有酪氨酸激酶活性。MET受体与肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)结合，可诱导MET二聚体处于激活状态，从而磷酸化，激活下游信号通路。这种的传递异常会造成多方面的影响，包括细胞生长、侵袭及转移等。MET的活化形式多样，包括MET基因扩增、MET蛋白过表达和MET基因突变。
[0003]MET 14号外显子跳跃突变在非小细胞肺癌中的总发生率为3％
‑
6％，在肺腺癌中的发生率为3％
‑
4％，在肺肉瘤样癌中的发生率可高达22％。另外其他癌症类型如胃癌、结直肠癌、脑胶质瘤都发现了MET基因的14号外显子跳跃突变。
[0004]研究表明MET 14号外显子突变的非小细胞肺癌患者即使具有高突变负荷(TMB)和PD
‑
L1强阳性，接受免疫治疗仍然疗效不佳。然而MET外显子14突变患者接受靶向治疗疗效不错。有报道克唑替尼治疗MET外显子14突变的晚期肺癌有显着和持久的反应(肿瘤部分缓解)，其后陆续有多个MET靶向药治疗MET 14号外显子跳跃突变的晚期肺癌疗效良好的案例报道。MET 14号外显子跳跃突变已成为靶向治疗非小细胞肺癌的重要靶点。
[0005]目前现有的用于检测MET 14号外显子跳跃突变的方法主要包括c
‑
MET免疫组化染色、直接针对DNA的Sanger测序以及下一代测序(next
‑
generation sequencing，NGS，又称高通量测序)。c
‑
MET免疫组化染色由于需要较多临床标本，且其用于检测MET 14号外显子。
[0006]跳跃突变的特异度较低，故临床较少应用。NGS是目前获得美国NCCN指南推荐的MET 14号外显子跳跃突变的检测方法。但是它的检测过程繁琐，需要较长的建库和检测周期，而且实验数据庞大，需要专业的生物信息人员进行筛选与分析，无法形成标准化的分析流程。同时检测的价格也是相当昂贵，对患者造成很大的经济负担。因此，需要一种能够快速、精准、高效地检测MET14号外显子跳跃突变的方法，从而可以筛选出潜在的肺癌患者，并对其进行精准治疗。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种一步法检测MET基因14号外显子跳跃突变的方法和试剂盒，解决了
技术介绍
中所提出的问题。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种一步法检测MET基因14号外显子跳跃突变的方法，包括以下步骤：
[0009]步骤一：采用特异的MET基因上游引物(跨13号外显子和15号外显子，并人为引物
碱基突变)、下游引物(位于15号外显子上)和探针(位于15号外显子上)，以及内参基因(GAPDH基因)特异性引物探针；
[0010]步骤二：结合一步法RT
‑
qPCR荧光定量PCR检测技术，PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。再通过实时监测整个PCR进程荧光信号的积累，与标准曲线对比进行定量分析；
[0011]步骤三：高灵敏高特异的检测肿瘤组织或胸腹水RNA样本中MET基因14号外显子跳跃突变。
[0012]作为本专利技术的一种优选实施方式，一种一步法检测MET基因14号外显子跳跃突变的方法，利用所述的一步法检测MET基因14号外显子跳跃突变的方法，所述一种一步法检测MET基因14号外显子跳跃突变的试剂盒的组成如下：
[0013]本检测试剂由10
×
RT
‑
qPCR buffer、dNTP Mix、引物探针混合液和酶混合液组成。
[0014]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述10
×
RT
‑
qPCR buffer包含150mM的Tris
‑
HCl(pH8.5)，300mM的氯化钾，20mM的氯化镁，0.5％Tween20，0.5％NP
‑
40，2.5mg/mL牛血清白蛋白，10％(W/V)海藻糖。为一步法RT
‑
qPCR反应提供所需要的金属离子，以及缓冲体系和其他辅助条件。
[0015]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述dNTP Mix由dATP/dCTP/dGTP/dTTP/dUTP混合而成，其混合比例为1:1:1:0.8:0.2，终浓度分别为10mM、10mM、10mM、8mM和2mM，为一步法RT
‑
qPCR反应提供延伸所需要的碱基。
[0016]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述引物探针混合液由特异性MET基因上下游引物探针和内参基因(GAPDH)上下游引物探针混合而成。其中MET基因上游引物(MET
‑
F)跨13号外显子和15号外显子，并将3
’
端第7个碱基A人为突变为G，引物序列为5
’‑
GAGAAAGCAAATTAAAGGTCAGTT
‑3’
，MET基因下游引物(MET
‑
R)在15号外显子上，引物序列为5
’‑
GACATGTCTGTCAGAGGATACT
‑3’
，MET基因探针(MET
‑
P)位于15号外显子上，探针序列为5
’‑
FAM
‑
TTCATCTCAGAACGGTTCATGCCGAC
‑
MGB
‑3’
；内参基因(GAPDH)上游引物(GAPDH
‑
F)序列为5
’‑
CATCTTCCAGGAGCGAGATCCC
‑3’
，内参基因(GAPDH)下游引物(GAPDH
‑
R)序列为5
’‑
ATGGTTCACACCCATGACGAACA
‑3’
，内参基因(GAPDH)探针(GAPDH
‑
P)序列为5
’‑
VIC
‑
CTGGCGCTGAGTACGTCGTGGAGTCC
‑
MGB
‑3’
。为一步法RT...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种一步法检测MET基因14号外显子跳跃突变的方法，包括以下步骤：步骤一：采用特异的MET基因上游引物(跨13号外显子和15号外显子，并人为引物碱基突变)、下游引物(位于15号外显子上)和探针(位于15号外显子上)，以及内参基因(GAPDH基因)特异性引物探针；步骤二：结合一步法RT
‑
qPCR荧光定量PCR检测技术，PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。再通过实时监测整个PCR进程荧光信号的积累，与标准曲线对比进行定量分析；步骤三：高灵敏高特异的检测肿瘤组织或胸腹水RNA样本中MET基因14号外显子跳跃突变。2.一种一步法检测MET基因14号外显子跳跃突变的方法，其特征在于，利用权利要求1中所述的一步法检测MET基因14号外显子跳跃突变的方法，所述一种一步法检测MET基因14号外显子跳跃突变的试剂盒的组成如下：本检测试剂由10
×
RT
‑
qPCR buffer、dNTP Mix、引物探针混合液和酶混合液组成。3.根据权利要求2所述的一种一步法检测MET基因14号外显子跳跃突变的试剂盒，其特征在于：所述10
×
RT
‑
qPCR buffer包含150mM的Tris
‑
HCl(pH8.5)，300mM的氯化钾，20mM的氯化镁，0.5％Tween20，0.5％NP
‑
40，2.5mg/mL牛血清白蛋白，10％(W/V)海藻糖。为一步法RT
‑
qPCR反应提供所需要的金属离子，以及缓冲体系和其他辅助条件。4.根据权利要求2所述的一种一步法检测MET基因14号外显子跳跃突变的试剂盒，其特征在于：所述dNTP Mix由dATP/dCTP/dGTP/dTTP/dUTP混合而成，其混合比例为1:1:1:0.8:0.2，终浓度分别为10mM、10mM、10mM、8mM和2mM，为一步法RT
‑
qPCR反应提供延伸所需要的碱基。5.根据权利要求2所述的一种一步法检测MET基因14号外显子跳跃突变的试剂盒，其特征在于：所述引物探针混合液由特...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨林，张惠丹，
申请(专利权)人：苏州绘真生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：