一种Tn5转座酶及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种Tn5转座酶及其制备方法。通过构建包含Tn5转座酶基因、内含肽基因、几丁质基因的全长目的基因序列，将其连接到载体后导入大肠杆菌表达，采用一种新型的蛋白融合表达及纯化系统，得到的纯化Tn5转座酶，可以高效的将Tn5转座子插入到目标序列，而且无序列偏向性选择。列偏向性选择。列偏向性选择。

【技术实现步骤摘要】
一种Tn5转座酶及其制备方法


[0001]本专利技术涉及生物酶
，具体为一种转座酶，尤其是一种Tn5转座酶及其制备方法。

技术介绍

[0002]Tn5转座子可在体外插入到含有靶DNA的载体上，在没有镁离子孵育时，Tn5转座子能够形成稳定的Tn5转座体复合体，可以通过电击进入活细胞，转座体经细胞内镁离子活化后，就能随机插入到宿主的基因组DNA中。
[0003]Tn5转座酶识别Tn5转座子序列的内端(inside end，IE)、外端(outside end，OE)和嵌合端(mosaic end，ME)序列，含有ME序列片段的体外转座效率最高。Tn5转座子的插入位点具有很高的随机性，因此被广泛的用于体外转基因(外源基因整合到宿主细胞)和二代测序建库等领域。
[0004]但是，目前行业内的Tn5转座酶普遍在打断DNA序列时，有序列偏向性，且稳定性不高。所以如何构建和制备一种新型的Tn5转座酶突变体，使Tn5转座酶在插入DNA序列时，无序列偏向性选择，而且稳定性更高，是本行业研究的热点和难点。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种Tn5转座酶及其制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0006]Tn5转座酶的酶活单位定义：1单位Tn5转座酶指37℃条件下反应1小时，完全切割1ug含有识别序列的DNA片段所需要的酶量。
[0007]一种Tn5转座酶，表达基因包括Tn5转座酶基因、内含肽基因和几丁质基因。
[0008]优选的，所述表达基因序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]优选的，所述表达基因表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]本专利技术通过构建包含Tn5转座酶基因、内含肽基因、几丁质基因的全长目的基因序列，将其连接到载体后导入大肠杆菌表达，采用一种新型的蛋白融合表达及纯化系统，得到的纯化Tn5转座酶，可以高效的将Tn5转座子插入到目标序列。
[0011]新型的蛋白融合表达及纯化系统(IMPACT)，IMPACT表达的目的蛋白与内含肽(intein)及几丁质结合蛋白(CBD)形成融合蛋白，通过几丁质柱亲和纯化融合蛋白，DTT诱导内含肽的肽键裂解活性，在几丁质介质上将目的蛋白释放出来，而内含肽与几丁质结合蛋白仍结合在几丁质介质上，达到单柱分离纯化蛋白的目的，该方法具备比以往的亲和层析纯化方法更加经济的特点，方法更加新颖，可提高目的蛋白表达的成功率。
[0012]具体制备过程如下：
[0013]1、构建载体，种子培养，得到含目的基因的质粒；2、诱导表达：将目的基因的质粒转入大肠杆菌中表达；3、菌体富集处理，破碎大肠杆菌，得到粗酶裂解液；4、疏水层析，去除疏水性差异大的杂质；5、几丁质(Chitin)亲和层析，捕获Tn5、几丁质、内含肽的融合蛋白；
6、采用DTT切断内含肽，剔除几丁质标签，得到粗的Tn5转座酶；7、采用离子交换层析对Tn5进行精纯；8、采用凝胶过滤层析将Tn5转座酶置换到保存液中；9、通过超滤浓缩得到高纯度高浓度的Tn5转座酶。
[0014]优选的，所述质粒载体为pET
‑
28a，所述RBS如SEQ ID NO.3所示。
[0015]本专利技术的制备原理如下：
[0016]1)按照SEQ ID NO.1合成全长基因序列
[0017]2)将拼接的全长基因序列Xho I和Xba I双酶切，通过T4连接酶克隆在pET
‑
28a载体上。
[0018]3)连接产物转化DH5α感受态细胞中通过涂布硫酸卡那霉素抗性的平板培养。
[0019]4)通过PCR筛选阳性克隆。并通过测序验证突变体。
[0020]5)将筛选好的阳性克隆转化Rosetta感受态细胞，诱导表达。
[0021]6)大肠杆菌湿菌体破碎诱导后的细胞，通过亲和层析色谱、几丁质树脂和离子交换色谱等纯化目的蛋白。
[0022]7)对突变体活性进行检测。
[0023]本专利技术通过IMPACT系统表达的Tn5转座酶，增加了Tn5转座酶的无序列偏向性和热稳定性。
[0024]与现有技术相比，本专利技术所达到的有益效果是：
[0025]1、相较于其他的Tn5转座酶及其制备方法，通过本专利技术的方法获得的Tn5转座酶的纯度和浓度更高。
[0026]2、采用本专利技术提供的新型的蛋白融合表达及纯化系统(IMPACT)，简化了常规的繁琐提取过程，获得的Tn5转座酶可以高效的将Tn5转座子插入到目标序列、具有无序列偏向性，表现对目的片段(300
‑
600bp)分选更集中、Tn5转座子插入到目标序列的稳定性更高。
附图说明
[0027]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：
[0028]图1是IMPACT的工作原理示意图；
[0029]图2是本专利技术的Tn5转座酶的制备过程流程示意图；
[0030]图3是目的基因的质粒图谱Tn5转座酶序列信息；
[0031]图4是实施例4中制备的Tn5转座酶疏水层析色谱图一；
[0032]图5是实施例4中制备的Tn5转座酶疏水层析色谱图二；
[0033]图6是实施例4中制备的Tn5转座酶疏水层析电泳图一；
[0034]图7是实施例4中制备的Tn5转座酶疏水层析电泳图二；
[0035]图8是实施例5中制备的Tn5转座酶Ni柱层析色谱图一；
[0036]图9是实施例5中制备的Tn5转座酶Ni柱层析色谱图二；
[0037]图10是实施例5中制备的Tn5转座酶Ni柱层析电泳图一；
[0038]图11是实施例5中制备的Tn5转座酶Ni柱层析电泳图二；
[0039]图12是实施例6的Chitin亲和的蛋白电泳图一；
[0040]图13是实施例6的Chitin亲和的蛋白电泳图二；
[0041]图14是实施例7的获得的Tn5转座酶离子交换层析图；
[0042]图15是实施例7的获得的Tn5转座酶离子交换电泳图一；
[0043]图16是实施例7的获得的Tn5转座酶离子交换电泳图二；
[0044]图17是实施例7的获得的Tn5转座酶离子交换电泳图三；
[0045]图18是实施例7的获得的Tn5转座酶离子交换电泳图四；
[0046]图19是实施例8的获得的Tn5转座酶凝胶过滤层析图一；
[0047]图20是实施例8的获得的Tn5转座酶凝胶过滤层析图二；
[0048]图21是实施例8的获得的Tn5转座酶离子交换电泳图一；
[0049]图22是实施例8的获得的Tn5转座酶离子交换电泳图二；
[0050]图23是实施例8的获得的Tn5转座酶离子交换电泳图三；
[0051]图24是实施例8的获得的Tn5转座酶离子交换电泳图四；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Tn5转座酶，其特征在于：表达基因包括Tn5转座酶基因、内含肽基因和几丁质基因。2.根据权利要求1所述的一种Tn5转座酶，其特征在于：所述表达基因序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求2所述的一种Tn5转座酶，其特征在于：所述表达基因表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.一种Tn5转座酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)合成含Tn5转座酶基因、内含肽基因和几丁质基因的表达基因；(2)通过大肠杆菌表达系统获得Tn5转座酶、几丁质、内含肽的融合蛋白；(3)几丁质亲和层析，捕获Tn5转座酶、几丁质、内含肽的融合蛋白；(4)采用DTT切断内含肽，剔除几丁质标签，得到粗的Tn5转座酶；(5)采用层析法对粗的Tn5转座酶进行精纯和浓缩获得Tn5转座酶。5.如权利要求4所述的一种Tn5转座酶的制备方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴宁，张惠丹，
申请(专利权)人：苏州绘真生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：