用于构建人单细胞BCR测序文库的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于构建人单细胞BCR测序文库的试剂盒及其应用。其中，一种基于所述试剂盒的人单细胞BCR测序文库构建方法包括：利用微流控芯片进行单细胞捕获和包装的步骤；以及，RNA反转录、cDNA预扩增、一次扩增、二次扩增、片段化、扩增、纯化等步骤。本发明专利技术的试剂盒和人源单细胞BCR测序文库在应用于免疫细胞的免疫组库测序时，单次实验可以分离500-30000个细胞，从根本上解决了单细胞免疫组库的通量问题，在肿瘤微环境、感染性疾病、器官移植后排斥、免疫治疗等领域中有着广泛的应用前景。免疫治疗等领域中有着广泛的应用前景。免疫治疗等领域中有着广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
用于构建人单细胞BCR测序文库的试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及一种试剂盒，具体涉及一种人源单细胞BCR(B细胞受体)测序文库的构建方法、用于构建人源单细胞BCR测序文库的试剂盒及人源BCR测序方法，属于分子生物学领域。

技术介绍

[0002]免疫组库(immune repertoire，IR)是指在任何指定时间，某个个体的循环系统中所有功能多样性B细胞和T细胞的总和。传统的免疫组库研究技术往往只能检测TCR(T细胞受体)和BCR一条链的序列信息，而单细胞免疫组库测序可以同时获取TCRα链和β链、BCR的重链和轻链以及一个细胞内的组合信息。
[0003]单细胞免疫组库测序技术是一种在单个细胞水平同时对适应性免疫受体库进行高通量测序的新技术，为免疫组学研究提供更具扩展性的平台。
[0004]传统的一些单细胞测序技术各有不足，例如，基于流式细胞仪的测序方法样本需求量大，需要精准控制，对细胞有损伤，对于后续建库要求高；基于C1系统(Fluidigm公司)的测序技术使用微阀分离单细胞，通量较低，最多只能做938个细胞，且成本高；基于Microwell(微孔板)方式的测序技术细胞捕获率低，污染高；基于现有的其他微流控平台的测序技术操作繁琐，时间长。
[0005]目前，单细胞免疫组库测序一般是基于10X Genomics平台进行的，其一次性能够分离500～10000个单细胞，并可以同时获取5
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基因表达的数据和TCR/BCR的V(D)J全长序列。然而，10X Genomics平台在分离单细胞的个数上有局限性，且对细胞活性要求较高。同时，基于10X Genomics的单细胞免疫组库测序的价格昂贵。

技术实现思路

[0006]本专利技术的主要目的在于提供一种用于构建人单细胞BCR测序文库的试剂盒及其应用，从而克服现有技术的不足。
[0007]为了达到前述专利技术目的，本专利技术采用了以下方案：
[0008]本专利技术实施例提供了一种用于构建人单细胞BCR测序文库的试剂盒，其包括：
[0009]微流控芯片，至少用于捕获人源B细胞单细胞并进行包装，从而生成油包水反应液滴，所述油包水反应液滴包括油相和被油相包裹的细胞液相，并且所述油包水反应液滴中包含有RNA反转录组件和细胞裂解试剂；
[0010]用于形成所述油相的油、细胞裂解试剂；
[0011]细胞标签，包括可变形微珠和连接在可变形微珠上的分子标签，所述分子标签用于标识细胞；
[0012]RNA反转录组件，包含SEQ ID NO:17所示的反转录引物、RNA反转录酶、RNA反转录酶抑制剂和RNA反转录缓冲液；
[0013]cDNA预扩增组件，包含SEQ ID NO:18所示的cDNA预扩增引物、DNA聚合酶和扩增缓
冲液；
[0014]第一扩增组件，包含SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8所示的引物、DNA聚合酶和扩增缓冲液；
[0015]第二扩增组件，包含SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:16所示的引物、DNA聚合酶和扩增缓冲液；
[0016]转座片段化组件，包含转座酶、转座酶反应缓冲液和转座反应终止液；
[0017]第三扩增组件，包含两个测序接头、DNA聚合酶和扩增缓冲液。
[0018]本专利技术实施例还提供了一种人单细胞BCR测序文库的构建方法，其包括：
[0019]利用微流控芯片进行人源B细胞单细胞捕获并进行包装，从而生成包含单细胞的油包水反应液滴；
[0020]对所述油包水反应液滴中的细胞进行裂解、反转录，获得反转录产物；
[0021]对所述反转录产物进行预扩增，之后依次进行第一次扩增、第二次扩增，获得扩增产物；
[0022]对所述扩增产物进行片段化、扩增、纯化处理，生成测序文库；
[0023]其中，所述第一次扩增所用的引物组合物包含SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8所示的引物，所述第二次扩增所用的引物组合物包含SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:16所示的引物。
[0024]在本专利技术前述实施例的一些实施方案中，所述微流控芯片包括细胞微流道、细胞隔离介质微流道、细胞标签微流道和单细胞样本收集口，所述细胞微流道具有细胞悬液入口和单细胞悬液出口，所述细胞隔离介质微流道具有细胞标签悬液入口和细胞标签悬液出口，并且所述单细胞悬液出口与细胞标签悬液出口交会，使所述细胞微流道输出的单细胞悬液能够与所述细胞标签微流道输出的细胞标签悬液混合形成细胞载液，所述细胞载液的流动路径与所述细胞隔离介质微流道交叉，从而使在所述细胞隔离介质微流道内流动的细胞隔离介质能够剪切并包裹细胞载液，从而形成包含单细胞的油包水反应液滴，所述包含单细胞的油包水反应液滴由单细胞样本收集口输出。
[0025]本专利技术实施例还提供了一种人源BCR测序方法，其包括：采用前述的任一种方法构建人单细胞BCR测序文库，之后进行测序分析。
[0026]较之现有技术，本专利技术利用微流控技术设计了一种人源单细胞BCR分离、测序文库的构建方法及试剂盒，其在应用于免疫细胞的免疫组库测序时，单次实验可以分离500-30000个细胞，从根本上解决了单细胞免疫组库的通量问题，在肿瘤微环境、感染性疾病、器官移植后排斥、免疫治疗等领域中有着广泛的应用前景。
附图说明
[0027]图1是本专利技术一典型实施方案中一种人源单细胞BCR测序文库的构建工艺流程图；
[0028]图2是本专利技术一典型实施方案中一种微流控芯片的结构示意图；
[0029]图3是本专利技术一具体实施案例中于微流控芯片中生成油包水反应液滴时的光学照片；
[0030]图4是本专利技术一具体实施案例中一种测序文库的质控结果图；
[0031]图5是本专利技术一具体实施案例中一种生物信息分析流程图；
[0032]图6是本专利技术一具体实施案例中的Clonotypes丰度图。
具体实施方式
[0033]本专利技术实施例的一个方面提供了一种用于构建人单细胞BCR测序文库的试剂盒，其包括：
[0034]微流控芯片，至少用于捕获人源B细胞单细胞并进行包装，从而生成油包水反应液滴，所述油包水反应液滴包括油相和被油相包裹的细胞液相，并且所述油包水反应液滴中包含有RNA反转录组件和细胞裂解试剂；
[0035]用于形成所述油相的油、细胞裂解试剂；
[0036]细胞标签，包括可变形微珠和连接在可变形微珠上的分子标签，所述分子标签用于标识细胞；
[0037]RNA反转录组件，包含SEQ ID NO:17所示的反转录引物、RNA反转录酶、RNA反转录酶抑制剂和RNA反转录缓冲液；
[0038]cDNA预扩增组件，包含SEQ ID NO:18所示的cDNA预扩增引物、DNA聚合酶和扩增缓冲液；
[0039]第一扩增组件，包含引物、DNA聚合酶和扩增缓冲液；
[0040]第二扩增组件，包含引物、DNA聚合酶和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于构建人单细胞BCR测序文库的试剂盒，其特征在于包括：微流控芯片，至少用于捕获人源B细胞单细胞并进行包装，从而生成油包水反应液滴，所述油包水反应液滴包括油相和被油相包裹的细胞液相，并且所述油包水反应液滴中包含有RNA反转录组件和细胞裂解试剂；用于形成所述油相的油、细胞裂解试剂；细胞标签，包括可变形微珠和连接在可变形微珠上的分子标签，所述分子标签用于标识细胞；RNA反转录组件，包含SEQ ID NO:17所示的反转录引物、RNA反转录酶、RNA反转录酶抑制剂和RNA反转录缓冲液；cDNA预扩增组件，包含SEQ ID NO:18所示的cDNA预扩增引物、DNA聚合酶和扩增缓冲液；第一扩增组件，包含SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8所示的引物、DNA聚合酶和扩增缓冲液；第二扩增组件，包含SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:16所示的引物、DNA聚合酶和扩增缓冲液；转座片段化组件，包含转座酶、转座酶反应缓冲液和转座反应终止液；第三扩增组件，包含两个测序接头、DNA聚合酶和扩增缓冲液。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述微流控芯片包括细胞微流道、细胞隔离介质微流道、细胞标签微流道和单细胞样本收集口，所述细胞微流道具有细胞悬液入口和单细胞悬液出口，所述细胞隔离介质微流道具有细胞标签悬液入口和细胞标签悬液出口，并且所述单细胞悬液出口与细胞标签悬液出口交会，使所述细胞微流道输出的单细胞悬液能够与所述细胞标签微流道输出的细胞标签悬液混合形成细胞载液，所述细胞载液的流动路径与所述细胞隔离介质微流道交叉，从而使在所述细胞隔离介质微流道内流动的细胞隔离介质能够剪切并包裹细胞载液，从而形成包含单细胞的油包水反应液滴，所述包含单细胞的油包水反应液滴由单细胞样本收集口输出。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述细胞微流道的尾部区域设置为单细胞通道，所述单细胞通道的宽度等于或稍大于单细胞直径，所述单细胞通道的出口与细胞标签微流道的出口交会，使得从所述细胞微流道输出的单细胞悬液与从所述凝胶微珠分子标签微流道输出的凝胶微珠分子标签悬液混合形成细胞载液，所述细胞载液的连续流动路径与所述细胞隔离介质微流道交叉，使得流经所述细胞隔离介质微流道的细胞隔离介质能够将连续的细胞载液剪切为离散液滴状的细胞液相并使每一细胞液相包含单细胞和单个细胞标签，同时使所述细胞隔离介质作为油相对所述细胞液相进行包裹，从而形成所述油包水反应液滴。4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述微流控芯片还包括分别与所述细胞微流道、细胞隔离介质微流道、细胞标签微流道连通的细胞悬液加样杯、细胞隔离介质加样杯、细胞标签加样杯。5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：所述单细胞样本收集口处设置有负压动力生成装置，所述负压动力生成装置用于在微流控芯片内产生负压，从而驱使各微流道中的流体流动。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述油相包含油和细胞裂解试剂，所述细胞液相包含RNA反转录组件；优选的，所述油与细胞裂解试剂的体积比...

【专利技术属性】
技术研发人员：张惠丹，赵洪玉，
申请(专利权)人：苏州绘真生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：