本发明专利技术公开了一种UDG酶的酶活测定组合物及测定方法，该测定组合物包括含U碱基的UDGA荧光探针和UDG酶测活缓冲液，利用现有的已精确标定酶活的商品化的UDG酶和含U碱基的荧光探针系统反应，用荧光定量PCR仪设定条件进行反应后，以荧光量和UDGA探针不同浓度得到标准曲线，求出K值，然后获得待测酶合适的稀释倍数以便荧光量可以落在标准曲线范围内，然后用待测酶的荧光量除以K值，在根据倍数换算得到的酶活。本发明专利技术变异系数在11.03％以内，实验偏差为在0.74％以内。所以我们认为UDG酶测活方法可行，从而将极大的克服现在行业内普遍存在的UDG酶活测定灵敏度偏低，损耗时间长，操作繁琐等缺点。等缺点。等缺点。
【技术实现步骤摘要】
一种UDG酶的酶活测定组合物及测定方法
[0001]本专利技术涉及DNA糖基化酶
，具体为尿嘧啶DNA糖基化酶检测体系及其检测方法。
技术介绍
[0002]分子信标(Molecularbeacon)是一种荧光标记的寡核苷酸链。一般有三部分组成：
①
环状区：由15～30个可以与靶分子特异结合的核苷酸组成；
②
茎干区：一般由5～8个可发生可逆性解离的碱基对组成；
③
荧光基团和淬灭基团：分子信标的两个末端分别标记荧光基团和淬灭基团。如概述图所示，没有靶分子的时候，分子信标的荧光和淬灭基团靠得很近，荧光被淬灭。与靶分子结合后，分子信标的空间构型发生改变，导致荧光恢复。因为分子信标技术具有极高的特异性和灵敏度，所以在临床诊断、基因检测、环境监测、活细胞成像、基因芯片与生物传感等方面得到了广泛应用。最近几年，为了提高检测目标分子的灵敏度，循环扩增技术在分子信标中的应用成为了研究热点，并广泛地应用于了各类目标分子的检测中去。
[0003]DNA糖基化酶是一类在碱基切除修复(BER)过程中负责损伤碱基识别和切除的起始酶，它的功能的异常会导致碱基切除修复机制无法运行，从而引发多种疾病，如人类免疫缺陷、神经退行性变、淋巴瘤、绽放综合征以及乳腺癌等。因此，尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)活性的超灵敏检测对于基础生物医学的研究和人类各种疾病的早期临床诊断有着十分重要的作用。到目前为止，已发展出多种方法用于尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)活性的检测，其中凝胶电泳结合放射性标记被认为是检测方法中的“黄金标准”。但是该方法具有一些无法克服的缺点，如放射性污染，检测灵敏度低，以及消耗时间长等。近年来已研发出一些新的用于检测尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)活性的方法，如比色分析法，电化学分析法和以及荧光分析法。其中，比色分析法通过过氧化氢氧化2,2'
‑
联氮双(3
‑
乙基苯并噻唑啉
‑6‑
磺酸)二铵盐(ABTS2
‑
)产生有色的ABTS
‑
，使尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)的活性可视化，但是其检测灵敏度无法与电化学方法和荧光方法相比。电化学分析方法在一定程度上提高了检测灵敏度，但是需要将捕获探针固定在固化载体上以及需要提前制备石墨烯电极，既耗时又费力。荧光方法设计简单，操作方便，但无法避免检测灵敏度低以及信号不稳定等缺点。综上，尽管这些检测尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)活性的方法有效，但是仍然存在灵敏度偏低，损耗时间长，操作繁琐等缺点。
技术实现思路
[0004]基于上述情况，我们公开了一种UDG酶的酶活测定组合物及测定方法，解决上述技术问题。
[0005]本专利技术采用荧光探针法进行酶活相对定量测定，我们设计一个含U碱基的荧光探针，在37℃恒温条件下，UDG酶特异性识别且切除荧光探针UDGA的U碱基，使探针断裂，发光基团和淬灭基团分开，测得荧光推算出酶活性。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]一种UDG酶的酶活测定组合物，包括去RNA酶水、UDGA探针、UDG酶标准品、UDG酶测活缓冲液和Endo VIII酶，所述UDGA探针为发夹型结构，两端分别连接发光基团和猝灭基团，直链部分包含U碱基。
[0008]优选的，所述UDG酶测活缓冲液的配方包括：去RNA酶水、20mM Tris8.0、10mM NaCl、1mM DTT、0.1mM EDTA、0.05％CA630、0.05％Tween 20、2％Glycerol和0.1mg/ml BSA。
[0009]优选的，当UDG酶标准品过量时，所述UDGA探针反应体系按体积比例为：UDG酶标准品1份、Endo VIII酶0.25份、10倍的UDG酶测活缓冲液2.3份、去RNA酶水19.45份、UDGA探针2份；
[0010]当UDGA探针过量时，所述UDG酶反应体系按体积比例为：UDGA探针1份、10倍的UDG酶测活缓冲液2.3份、Endo VIII酶0.25份、去RNA酶水19.45份、待测的UDG酶2份
[0011]优选的，所述UDGA探针的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述碱基序列中的ATCAUC和GATGAT是相互配对的双联部分，其余为环状部分。
[0012]优选的，包括以下步骤：
[0013](1)以UDGA探针不同浓度梯度为横坐标，根据所述UDGA探针反应体系，以反应速率稳定后的某一时间的信号值与起始信号值的差值ΔRn建立标准曲线，
[0014](2)稀释不同梯度的UDG酶标准品，根据所述UDG酶反应体系，获得与所述步骤(1)的ΔRn范围相对应的稀释倍数N范围；
[0015](3)在同一反应过程中，
[0016]以UDGA探针不同浓度梯度为横坐标，根据所述UDGA探针反应体系，以反应速率稳定后的某一时间的信号值与起始信号值的差值ΔRn建立标准曲线，获得标准曲线的K值；
[0017]将待测酶稀释到步骤(2)获得的稀释倍数N，根据所述UDG酶反应体系，获得稀释后的待测酶的ΔRn；
[0018]待测酶的酶活＝待测酶的ΔRn
÷
K*N，式中，K为标准曲线的斜率，N为待测酶的稀释倍数。
[0019]优选的，所述反应速率稳定后的某一时间为30分钟。
[0020]优选的，所述反应条件为37℃，30s，反应30min。
[0021]优选的，当所述UDGA探针反应对应的酶活单位为mU时，所述待测酶的酶活U/ul＝待测酶的ΔRn
÷
K
÷
C*N；
[0022]式中，C为mU与U的换算系数1000。
[0023]对上述技术方法的进一步的补充说明具体内容如下：
[0024]一种UDG酶的酶活测定组合物包括：UDGA探针、10
×
UDG酶测活Buffer组成成分。
[0025]一、准备10
×
UDG酶测活缓冲液
[0026]10
×
UDG酶测活Buffer组成成分如下。
[0027][0028]二、合成含U碱基的发夹型UDGA探针。
[0029]三、标准曲线建立
[0030]3.1本专利技术需要使用商品酶或者待测酶，不是特定的，建立UDGA探针标准曲线，具体详见实施例。
[0031]3.2行业中每家商业酶提供商的酶活测定方法都不相同。
[0032]关于本专利技术的发夹型探针在体系中的反应原理说明：
[0033]本专利技术的UDG酶酶活定义为：37℃条件下，30min内使1nmol的尿嘧啶释放游离时，所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。终反应体积为25uL。我们以30min消耗的UDGA来计算酶单位。
[0034]消耗1nmol尿嘧啶对应消耗1nmol的UDGA探针，对应1U；
[0035]本专利技术的建立UDGA探针标准曲线本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种UDG酶的酶活测定组合物，其特征在于：包括去RNA酶水、UDGA探针、UDG酶标准品、UDG酶测活缓冲液和Endo VIII酶，所述UDGA探针为发夹型结构，两端分别连接发光基团和猝灭基团，直链部分包含U碱基。2.根据权利要求1所述的一种UDG酶的酶活测定组合物，其特征在于：所述UDG酶测活缓冲液的配方包括：去RNA酶水、20mM Tris8.0、10mM NaCl、1mM DTT、0.1mM EDTA、0.05％CA630、0.05％Tween 20、2％Glycerol和0.1mg/ml BSA。3.根据权利要求2所述的一种UDG酶的酶活测定组合物，其特征在于：当UDG酶标准品过量时，所述UDGA探针反应体系按体积比例为：UDG酶标准品1份、Endo VIII酶0.25份、10倍的UDG酶测活缓冲液2.3份、去RNA酶水19.45份、UDGA探针2份；当UDGA探针过量时，所述UDG酶反应体系按体积比例为：UDGA探针1份、10倍的UDG酶测活缓冲液2.3份、Endo VIII酶0.25份、去RNA酶水19.45份、待测的UDG酶2份。4.根据权利要求3所述的一种UDG酶的酶活测定组合物，其特征在于：所述UDGA探针的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述碱基序列中的ATCAUC和GATGAT是相互配对的双联部分，其余为环状部分。5.根据权利要求4所述的一种UD...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵春艳，张惠丹，
申请(专利权)人：苏州绘真生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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