本发明专利技术公开了噬菌体解聚酶ORF38蛋白在多杀性巴氏杆菌荚膜分型鉴定中的应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术首次发现噬菌体解聚酶ORF38蛋白仅对PmD有裂解作用，对其它荚膜血清型的多杀性巴氏杆菌(包括A，B，E和F)和其它细菌如大肠杆菌、沙门菌、副猪嗜血杆菌、支气管波氏败血杆菌、链球菌和金黄色葡萄球菌等均没有裂解作用，因此能用于PmD荚膜分型鉴定，具有简单、快捷、准确等优点。准确等优点。准确等优点。
【技术实现步骤摘要】
噬菌体解聚酶ORF38蛋白在多杀性巴氏杆菌荚膜分型鉴定中的应用
[0001]本专利技术属于生物领域，涉及噬菌体解聚酶ORF38蛋白在多杀性巴氏杆菌荚膜分型鉴定中的应用，本专利技术还涉及一种多杀性巴氏杆菌荚膜分型鉴定方法。
技术介绍
[0002]多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)是可引起多种畜禽巴氏杆菌病的病原体，对养殖畜牧业危害较为严重。该病原的宿主范围较广，可在多种动物之间进行传播，引起动物出血败血症或传染性肺炎。重要的是，Pm也能够感染人类，对于免疫体系不健全的个体经过带有病原Pm的动物抓伤、咬伤，可因败血症而导致死亡。此外，猪群中猪萎缩性鼻炎(wine infectious atrophic rhinitis,ARS)通常与D型多杀性巴氏杆菌(PmD)有关此类疾病广泛存在和流行于全世界范围内的猪场，给养猪业带来了重大的经济损失。除此之外，Pm还在猪呼吸道疾病综合征(Porcine Respiratory Disease Complex,PRDC)中扮演着重要角色。
[0003]Pm传统的分型方法主要是根据血清型进行分型，包括卡特荚膜分型法和赫德尔斯顿菌体或者脂多糖分析法。卡特荚膜分型法主要是运用间接的血凝法将Pm分型A、B、D、E和F五个荚膜血清型。而赫德尔斯顿菌体或者脂多糖分析法主要是根据琼脂凝胶扩散沉淀素试验将Pm分为1
‑
16个菌体或者脂多糖血清型。目前，对于临床分离得到的Pm的血清型鉴定主要根据卡特荚膜分型法。使用常规的PCR方法即可鉴定相应的血清型。
[0004]传统的Pm检测方法通过细菌的纯培养或者通过PCR特异性引物对PmD荚膜血清进行鉴定。PCR检测的方法虽然灵敏度高、特异性强，但需要耗费试剂以及可能出现的核酸污染等问题容易造成假阳性的出现。另外，在规模化养殖场中，PCR检测方法需要专业的技术人员操作，难以满足生产的需要。因此，需要一种简单、快捷、准确的方法来鉴定Pm。
[0005]大量的研究表明，一些噬菌体能够产生降解细菌胞外聚合物基质的多糖解聚酶，继而裂解并杀死宿主菌，噬菌体解聚酶具有化学性质和生物学效应稳定的特点，适合于大量生产，这为多重耐药菌感染的治疗提供了新的思路。由于不同解聚酶对其作用底物有不同的作用结构，并有其特异性的作用方式，因此噬菌体解聚酶在细菌鉴定和分型方面的应用潜力更大，已有研究者利用噬菌体解聚酶开展了肺炎克雷伯菌的荚膜分型。迄今为止，尚未发现有人利用解聚酶对多杀性巴氏杆菌进行荚膜分型。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的是提供噬菌体解聚酶ORF38蛋白在多杀性巴氏杆菌荚膜血清分型鉴定中的应用，本专利技术还提供一种多杀性巴氏杆菌荚膜血清分型鉴定方法以及试剂盒。
[0007]为实现上述目的，申请人以噬菌体PHB01为模板，设计引物并扩增目的片段基因，构建表达载体并转化感受态细胞，最后得到表达噬菌体解聚酶ORF38基因的重组蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0008]接着，申请人通过研究蛋白的性能，发现其具有良好的热稳定性和pH稳定性，并能特异性裂解PmD，因此能应用于多杀性巴氏杆菌的荚膜分型鉴定，尤其是荚膜血清型为D的Pm鉴定。
[0009]一种多杀性巴氏杆菌荚膜分型鉴定方法，包括以下步骤：
[0010](1)将培养至生长对数期的多杀性巴氏杆菌菌液与含有琼脂的TSB培养基混合，倾倒至下层平板，制备双层平板；
[0011](2)使用PBS缓冲液稀释所述噬菌体解聚酶ORF38蛋白，将蛋白稀释液点斑至步骤(1)中的双层平板上，孵育后观察结果。
[0012]优选地，步骤(1)中，所述菌液与培养基的体积比为1：20。
[0013]优选地，所述PBS缓冲液的pH＝6.0。
[0014]优选地，所述孵育的温度是34
‑
38℃，时间10
‑
15h。
[0015]一种用于多杀性巴氏杆菌荚膜分型鉴定的试剂盒，该试剂盒含有所述的噬菌体解聚酶ORF38蛋白。
[0016]本专利技术的有益效果是：
[0017](1)首次发现噬菌体解聚酶ORF38蛋白仅对PmD有裂解作用，对其它荚膜血清型的多杀性巴氏杆菌(包括A，B，E和F)和其它细菌如大肠杆菌、沙门菌、副猪嗜血杆菌、支气管波氏败血杆菌、链球菌和金黄色葡萄球菌等均没有裂解作用，因此可应用于多杀性巴氏杆菌荚膜分型鉴定。
[0018](2)本专利技术提供了一种有效简便PmD荚膜分型鉴定方法，将所使用的蛋白直接点斑在长满细菌的平板上，在培养箱中即可鉴定出PmD，具有简单、快捷、准确等优点。据我们所知，目前还没有使用该方法来鉴定PmD的报道。
附图说明
[0019]图1为ORF38重组蛋白纯化后的蛋白胶图结果。
[0020]图2为纯化后的ORF38重组蛋白点斑结果。
[0021]图3为ORF38重组蛋白的pH稳定性。
[0022]图4为ORF38重组蛋白的热稳定性。
具体实施方式
[0023]下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。
[0024]主要试验材料：
[0025]噬菌体PHB01：保存于山东省农业科学院畜牧兽医研究所。
[0026]pET
‑
28a载体：购买于Invitrogen公司。
[0027]BL21(DE3)感受态细胞：购买于Invitrogen公司。
[0028]实施例1重组蛋白的构建
[0029]1.基因的扩增
[0030]以噬菌体PHB01为模板扩增目的片段基因ORF38(Gene ID:54980989)。
[0031]正向引物：5
’‑
CCGGAATTC ATGTCATCAAGAGATATCAGTA
‑3’
EcoRI
[0032]反向引物：5
’‑
GCGTCGAC TCACAATTGACACCATTTATTCA
‑3’
SalI
[0033]扩增体系和扩增条件如下：
[0034][0035]PCR反应程序：98℃预变性5min；98℃预变性20s，60℃退火20s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
[0036]2.构建重组质粒
[0037](1)200ng的回收目的片段与100ng回收后的pET
‑
28a载体分别与限制性内切酶EcoRI和SalI在37℃酶切2h；
[0038](2)将酶切后的产物在T4连接酶的作用下4℃过夜连接；
[0039](3)取
‑
70℃冻存的感受态细胞于冰上融化后，取100μL于无菌的1.5mL EP管中，加入连接产物(约10μL)，混匀，于冰上放置30min；
[0040](4)42℃水浴热击90s，再放回冰上2min；<本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的噬菌体解聚酶ORF38蛋白在多杀性巴氏杆菌荚膜分型鉴定中的应用，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述多杀性巴氏杆菌的荚膜分型为D型。3.一种多杀性巴氏杆菌荚膜分型鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将培养至生长对数期的多杀性巴氏杆菌菌液与含有琼脂的TSB培养基混合，倾倒至下层平板，制备双层平板；(2)使用PBS缓冲液稀释噬菌体解聚酶ORF38蛋白，将蛋白稀释液点斑至步骤(1)中的双层平板上，孵育后观察结果，所述噬菌体解聚酶ORF38蛋白的氨基酸序列如SEQ ID ...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈义宝，刘玉庆，刘正洁，胡明，赵效南，张庆，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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