一种DTNS介导的检测8-OGDNA糖基化酶活性的方法技术

本发明专利技术属于生物检测和分子生物学技术领域，具体涉及一种DTNS介导的检测8

【技术实现步骤摘要】
一种DTNS介导的检测8
‑
OG DNA糖基化酶活性的方法


[0001]本专利技术属于生物检测和分子生物学
，具体涉及一种DTNS介导的检测8
‑
OG DNA糖基化酶活性的方法。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]8‑
氧化鸟嘌呤(8
‑
OG)DNA糖基化酶是一种DNA修复酶，用于修复一种常见的氧化DNA损伤8
‑
OG。该酶能识别双链DNA中的8
‑
OG，并切刻糖苷键生成无嘌呤/无嘧啶(AP)位点，然后AP位点被该酶固有的AP
‑
裂解活性切除。然而，细胞内8
‑
OG DNA糖化酶活性的异常可导致DNA复制过程中8
‑
OG与腺嘌呤之间错误的碱基配对，引起基因突变并增加一些疾病的发生率，包括消化系统肿瘤和肺部肿瘤。因此，准确和原位检测细胞内8
‑
OG DNA糖基化酶活性对理解8
‑
OG DNA糖基化酶的功能和进一步研究突变相关的疾病具有重要意义。
[0004]检测8
‑
OG DNA糖基化酶活性的方法包括放射性标记法、高效液相色谱法、电化学法、比色法和荧光法。这些方法通常检测缓冲溶液或细胞提取物中8
‑
OG DNA糖基化酶活性，不能直接反映该酶在活细胞复杂环境中的活性水平。为揭示8
‑
OG DNA糖基化酶参与的细胞过程并探索其作用机制，基于DNA功能化纳米材料的原位荧光方法已发展用于成像细胞内8
‑
OG DNA糖基化酶活性。这些原位荧光方法仅通过单一荧光信号强度来显示细胞内8
‑
OG DNA糖基化酶的活性信息。尽管已经取得了明显进展，这些依靠单一荧光信号强度的原位荧光方法仍受到细胞内核酸酶降解产生的假阳性信号的干扰，从而影响检测准确度。因此，准确和原位成像细胞内8
‑
OG DNA糖基化酶活性仍存在挑战。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术的不足，本专利技术提供一种DNA四面体纳米开关(DTNS)介导的检测8
‑
OG DNA糖基化酶活性的方法，在8
‑
OG DNA糖基化酶的作用下，DTNS的结构由开放态变为闭合态，使Cy3供体和Cy5受体之间的距离靠近，从而引发高效的FRET。利用本方法，不仅能够实现灵敏和选择性地检测细胞外的8
‑
OG DNA糖基化酶活性，基于FRET信号输出模式，还能预防核酸酶降解产生的假阳性信号，有利于活细胞内的准确成像。
[0006]本专利技术具体提供以下技术方案：
[0007]本专利技术第一方面提供一种DNA四面体纳米开关，包括：DNA四面体，DNA四面体的一个顶点上连接有双链DNA探针；
[0008]其中，所述双链DNA探针是由含8
‑
OG的识别链和标记有供体/受体双荧光团的报道链杂交而成。
[0009]本专利技术第二方面提供一种DTNS介导的检测细胞外目标物中8
‑
OG DNA糖基化酶活性的方法，具体为：
[0010](1)构建DNA四面体纳米开关；
[0011](2)将细胞外目标物、DNA四面体纳米开关共同孵育；
[0012](3)进行荧光光谱测量。
[0013]本专利技术第三方面提供一种DTNS介导的活细胞内8
‑
氧化鸟嘌呤DNA糖基化酶活性比率成像的方法，具体包括：
[0014](1)构建DNA四面体纳米开关；
[0015](2)将目标细胞、DNA四面体纳米开关共同孵育。
[0016](3)进行共聚焦激光扫描显微镜成像。
[0017]本专利技术的一个或多个实施方式至少具有以下有益效果：
[0018]本专利技术提供了一种DTNS介导的检测8
‑
OG DNA糖基化酶活性的方法。在8
‑
OG DNA糖基化酶的作用下，DTNS的结构由开放态变为闭合态，使Cy3供体和Cy5受体之间的距离靠近，从而引发高效的FRET。利用本方法，实现了灵敏和选择性地检测细胞外的8
‑
OG DNA糖基化酶活性。另外，基于FRET信号输出模式，本专利技术能预防核酸酶降解产生的假阳性信号，有利于活细胞内的准确成像。此外，再结合DTNS良好的细胞摄取能力，本专利技术已成功用于活细胞内8
‑
OG DNA糖基化酶活性的准确、原位成像。本专利技术提供了一个有前景的工具用于准确和原位分析细胞内8
‑
OG DNA糖基化酶活性，这有助于深入理解8
‑
OG DNA糖基化酶的功能和进一步研究突变相关的疾病。
附图说明
[0019]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0020]图1为DTNS
‑
介导的FRET策略用于比率成像活细胞内8
‑
OG DNA糖基化酶活性的原理图；
[0021]图2：(A)DNA四面体和(B)DTNS的琼脂糖凝胶电泳表征；(C)DTNS在目标物8
‑
OG DNA糖基化酶存在及不存在时的荧光发射光谱。
[0022]图3(A)不同浓度的目标物8
‑
OG DNA糖基化酶存在时，DTNS的荧光发射光谱；(B)F
A
/F
D
比值相对于目标物8
‑
OG DNA糖基化酶浓度的标准曲线；(C)当存在目标物或其他DNA糖基化酶时，DTNS的荧光发射光谱和(D)F
A
/F
D
比值；误差棒为三次平行实验结果的标准偏差。
[0023]图4为当DNaseI存在及不存在时，DTNS的F
A
/F
D
比值随时间的变化曲线；误差棒为三次平行实验结果的标准偏差。
[0024]图5利用(A)DTNS和(B)对照组DTNS共聚焦荧光成像HeLa细胞内8
‑
OG DNA糖基化酶活性；刻度尺：20μm。
具体实施方式
[0025]应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0026]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式
也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA四面体纳米开关，其特征在于：包括：DNA四面体，DNA四面体的一个顶点上连接有双链DNA探针；所述双链DNA探针由含8
‑
OG的识别链和标记有供体/受体双荧光团的报道链杂交而成。2.权利要求1所述的DNA四面体的制备方法，其特征在于：1)制备DNA四面体：将四条DNA链进行等摩尔量混合，并在90
‑
95℃下加热5
‑
10min，然后快速转移至冰水浴中冷却20
‑
40min，接着在3
‑
5℃下放置1
‑
2h；2)制备双链DNA探针R
‑
H：将识别链R和报道链H进行等摩尔量混合，并在25℃下孵育1
‑
1.5h；3)制备DTNS：将上述制备的DNA四面体和双链DNA探针R
‑
H进行等摩尔量混合，并在25℃下孵育1
‑
1.5h。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述制备DNA四面体、双链DNA探针R
‑
H、DTNS的过程，均在在1
×
PBS缓冲溶液中进行。4.一种DTNS介导的检测细胞外目标物中8
‑
OG DNA糖基化酶活性的方法，其特征在于：(1)构建DNA四面体纳米开关；(2)将...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴玉姝，吴敏，刘敏，韩军，
申请(专利权)人：聊城大学，
类型：发明
国别省市：