前药组合物中药物浓度的量化方法技术

提供了用于量化前药组合物中存在的药物的量的方法。的量的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】前药组合物中药物浓度的量化方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年5月7日提交的美国临时专利申请序列号62/844,579的优先权，将所述申请的全部公开内容通过引用以其整体并入本文。


[0003]本专利技术涉及用于量化前药组合物中存在的药物的量的方法。

技术介绍

[0004]在过去十年中，平均每年有17种新肽进入临床试验，批准率(从1期到上市)是小分子的两倍(Dharanipragada(2013)Future Medicinal Chemistry 5(7):831；(2013)Drug Discovery Today 18:807
‑
817)，而且目前正在开发的候选肽药物超过150种(Lau和Dunn(2018)Bioorganic&Medicinal Chemistry 26:2700
‑
2707)。
[0005]然而，肽药物的开发呈现特定的挑战。例如，肽药物经蛋白水解切割并在体内快速清除。口服递送仍然具有挑战性，部分是由于生物膜的低渗透性。已经尝试通过并入构象限制和开发聚合物药物缀合物来补救这些缺点，所述构象限制如环状肽形成(例如，通过内酰胺化和点击环化)、烃固定(hydrocarbon stapling)、脂化。
[0006]肽药物的一个例子是SAR425899，这是一种靶向胰高血糖素和GLP1受体并且可以促进2型糖尿病患者的血糖控制和体重减轻，以及健康志愿者的体重减轻的双重受体激动剂(Tillner等人(2019)Diabetes Obes.Metab.21:120,doi:10.1111/dom.13494,Epub 2018年9月16日)。然而，由于在体内快速清除，因此需要每天一次剂量的SAR425899。
[0007]透明质酸(HA)也称为玻尿酸(hyaluronan)，是一种天然存在的非硫酸盐线性多糖，其由通过β
‑1‑
3和β
‑1‑
4糖苷键连接的d
‑
葡糖醛酸和N
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乙酰基
‑
d
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葡萄糖胺的重复二糖单元组成(Khunmanee等人(2017)J.Tissue Engineering第8卷(doi:doi.org/10.1177/2041731417726464))。HA是皮肤中重要的结构元素并参与许多细胞表面受体相互作用。HA具有免疫抑制活性和抗血管生成活性，并存在于脑组织、透明软骨和滑膜关节液中。由于其强大的亲水性特征和其在生物组织中的高分子量(可吸收大量的水，高达其固体体积的1000倍)，HA在身体中展现出重要的结构作用和功能作用。
[0008]由于其生物相容性和可生物降解性，在生物医学应用和制药应用中发现了HA的许多应用。然而，HA是高度可溶性的并且常常展现出非常差的机械特性以及在体内快速降解的行为。因此，已将HA进行化学修饰和/或交联以改善其特性，包括机械特性、粘度、溶解性、降解和生物学特性。HA衍生物已被产生并且用于组织工程支架、软组织手术(如声带增强)、药物递送、siRNA的细胞内递送、伤口愈合，以及作为器具用于手术程序中。
[0009]交联透明质酸(xHA)在水性环境中形成数百万道尔顿的水凝胶，并且可以与药物(例如，肽药物)连接以在体内稳定所述药物。然而，要量化水凝胶中负载的药物的量以及量化药物从水凝胶释放的速率都有难度。典型地用于溶液中肽的基本量化的简单UV测量不能用于水凝胶，因为此类分析要求药物连接的水凝胶复合物是完全溶解的。
[0010]使用升高温度或升高pH来加速接头的水解和肽药物的释放的替代方法导致肽药物部分降解，因此产生难以量化的异质混合物。因此，需要分析型量化方法来对前药组合物在交联HA水凝胶上的载药量进行量化。

技术实现思路

[0011]为了解决在确定交联HA(xHA)水凝胶上载药量方面的分析挑战，例如以使得能够确定xHA水凝胶的肽负载量，发现了允许将测量为重量/重量百分比的药物负载量(例如，生物聚合肽前药负载量)准确量化的新型方法。本文描述的方法对于药物负载量确定具有高度选择性，所述方法可以应用于可分解成较小组分(例如，通过蛋白水解消化、水解等)的任何小分子(例如，多肽、多核苷酸等)，并且可以广泛应用于前药(例如，含生物聚合物的前药)的药物负载量确定。本文描述的方法可用于例如控制药物在体内的剂量递送，以及在制造过程中对前药批次之间的药物负载量进行质量控制。本文描述的方法使得能够产生增加体内半衰期的药物(例如，肽药物)，例如半衰期从数分钟增加至数天的药物如肽药物。
[0012]本文描述的方法提供了相对于本领域已知的先前方法(如基于NMR的方法)的多种优点。例如，与本文描述的方法相比，基于NMR的方法花费更长的时间并且具有更低的产量。基于NMR的方法需要毫克级的材料，而本文描述的新型方法仅需要纳克级的材料。此外，基于NMR的方法的动态范围比本文描述的新型方法的动态范围更低。另外，与本文描述的新型方法相比，基于NMR的方法更容易受到污染肽的干扰。
[0013]本文基于以下发现提供了新型方法：双重酶促消化接着量化一种或多种消化产物可以用于准确量化水凝胶上的药物负载量(例如，肽药物负载量)。在所述方法的某些实施方案中，将交联透明质酸
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接头
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肽(xHA
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L
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P)与酶一起孵育以消化所述交联透明质酸。随后施用蛋白水解酶以消化附着的肽并产生蛋白水解消化产物。将代表肽的所述蛋白水解消化产物随后进行量化。
[0014]在所述方法的某些示例性实施方案中，将交联透明质酸
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接头
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肽缀合物(xHA
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L
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P)称重，并作为水凝胶悬浮在缓冲液中。将所述水凝胶酶促地降解为可溶性的低聚透明质酸
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接头
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肽(oHA
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L
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P)。所得oHA
‑
L
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P低聚物以异质混合物的形式存在，由肽、接头和不同长度的低聚透明质酸组成。这种低聚透明质酸异质性对于基于质谱法的量化是不期望的，但是可以应用于基于特异性较低的UV或荧光的测定。因此，针对基于质谱法的参考测定，引入第二酶促(例如，内切蛋白水解)消化步骤以消化所述肽药物并产生均质的肽消化产物(例如，19个氨基酸的C末端肽消化产物DFIEWLKAGGPSSGAPPPS
‑
NH2(图3))。然后可以使用测定如例如液相色谱/高分辨率质谱法(LC/MS)对所述肽产物进行检测和量化。
[0015]一方面，提供了一种用于确定交联透明质酸
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接头
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肽(xHA
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L
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P)前药配制品中存在的药物的量的方法。所述方法包括以下步骤：使所述xHA
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L本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于确定交联透明质酸
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接头
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肽(xHA
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L
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P)前药配制品中存在的药物的量的方法，所述方法包括：使所述xHA
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L
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P前药配制品的样品与透明质酸葡糖苷酶接触以产生低聚透明质酸
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接头
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肽药物(oHA
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L
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P)；使所述oHA
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L
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P与第二种酶接触以产生所述药物的肽消化产物；和检测所述肽消化产物以确定所述xHA
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L
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P前药配制品中存在的所述药物的量。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽消化产物的长度在约2个氨基酸与约100个氨基酸之间。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽消化产物的长度在约3个氨基酸与约75个氨基酸之间。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽消化产物的长度在约4个氨基酸与约50个氨基酸之间。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽消化产物的长度在约6个氨基酸与约30个氨基酸之间。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽消化产物的长度在约15个氨基酸与约20个氨基酸之间。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽消化产物的长度为约1个、约2个、约3个、约19个氨基酸或这些的任意组合。8.根据权利要求1所述的方法，其中检测所述肽消化产物的所述步骤是通过选自液相色谱
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质谱法(LC
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MS)、液相色谱串联质谱法(LC
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MS
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MS)、液相色谱
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高分辨率质谱法(LC
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HRMS)、紫外线(UV)吸收和荧光检测中的一种或组合的方法进行的。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述透明质酸葡糖苷酶是透明质酸酶(HAase)。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述HAase选自HAase 1、HAase 2、HAase 3、HAase 4、HAase 5和HAase 6。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述HAase是HAase 1或HAase 2。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述HAase是HAase 2。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述透明质酸葡糖苷酶是透明质酸(HA)裂解酶EC 4.2.2.1。14.根据权利要求1所述的方法，其中使所述oHA
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L
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P与胞内蛋白酶接触。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述胞内蛋白酶选自Glu
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C、Asp
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N、Lys
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C、Arg
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C、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述胞内蛋白酶是Asp
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N。17.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括使用内标物。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述内标物包含一种或多种重同位素。19.根据权利要求1所述的方法，其中使用校准曲线确定存在的药物的量。20.根据权利要求1所述的方法，其中使所述xHA
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L
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P在压力循环仪中与所述透明质酸葡糖苷酶接触。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述压力循环仪中的压力大于大气压。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述压力为约5KPSI、约10KPSI或约15KPSI。
23.根据权利要求1所述的方法，其中使所述oHA
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L
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P在压力循环仪中与所述第二种酶接触。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述压力循环仪中的压力大于大气压。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述压力为约35KPSI、约40KPSI或约45KPSI。26.一种用于确定交联透明质酸
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接头
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肽(xHA
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L
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P)前药配制品中存在的药物的量的方法，所述方法包括：使所述xHA
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L
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P前药配制品的样品与透明质酸葡糖苷酶接触以产生低聚透明质酸
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接头
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肽药物(oHA
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L
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P)；使所述oHA
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L
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P与胞内蛋白酶接触以产生所述药物的肽消化产物；和检测所述肽消化产物以确定所述xHA
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L
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P前药...

【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：建新公司，
类型：发明
国别省市：