一种用于检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种单链DNA，以及一种用于检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B的试剂盒及其应用。本发明专利技术的试剂盒结合荧光检测能够灵敏且稳定地检测出不同浓度APOBEC3B的活性，更重要的是应用在筛选抑制剂上，可以避免检出假阳性抑制剂，且方便快捷、价格较低、原材料用量小，可以高通量筛选APOBEC3B抑制剂。并且能检测出不同组织、细胞中APOBEC3B的表达水平。细胞中APOBEC3B的表达水平。细胞中APOBEC3B的表达水平。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B的试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及涉及一种用于检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B的试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]人载脂蛋白B mRNA 编辑酶催化多肽（apolipoprotein B m RNA
‑
editing enzyme catalytic polypeptide , APOBEC）是人体内具有胞嘧啶脱氨酶活性的限制因子，共有11个成员，分别为APOBEC1（简称A1），APOBEC2（简称A2），AID，APOBEC3A（简称A3A），APOBEC3B（简称A3B），APOBEC3C（简称A3C），APOBEC3DE（简称A3DE），APOBEC3F（简称A3F），APOBEC3H（简称A3H）和APOBEC4（简称A4）。
[0003]近年来大量的基因组学研究显示，肿瘤能利用达尔文式的进化在细胞层面上完成选择、竞争和适应，从而实现肿瘤发生、微环境适应、浸润、转移以及耐药性的产生。这种基因组不稳定性赋予癌症高度复杂和动态的属性，其前提条件是 DNA 突变的不断产生。大规模的肿瘤细胞全基因组测序结果表明，由酶介导的主动的 DNA 突变是造成基因组异质性的主要途径之一，而核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC家族正是这一过程的作用酶。 APOBEC 家族酶能作用于单链 DNA 中的脱氧胞苷并通过脱氨基反应将其转化为脱氧尿苷，这一过程经过 DNA 复制/修复机制最终能产生包含 C>T 转换在内的多种突变。在正常细胞中这些突变对抵御病毒转导的外源核酸至关重要，但在肿瘤细胞中异常激活的 APOBEC 家族酶则推动了异质性的积累，并通过促进分支进化产生临床上难以治愈的耐药性克隆。
[0004]其中，APOBEC3B是胞苷脱氨酶中主导肿瘤基因组突变的酶。在APOBEC家族中，APOBEC3B是唯一核定位的成员，它在肿瘤细胞内选择性识别并编辑5
’‑
TC短序列，并能在DNA损伤修复机制下形成极具特征的TC>TT或TC>TG突变标签。一项于2013年发表在Nature期刊的研究结果表明，在乳腺癌中A3B是APOBEC家族酶中唯一普遍异常激活的成员，并且其表达量与TC短序列突变程度呈正相关。大规模肿瘤基因组测序表明，这些TC短序列突变标签大量存在于约50%的人类肿瘤中，而在胞苷脱氨酶家族中仅APOBEC3B在这些肿瘤中mRNA过表达。进一步的证据表明，APOBEC3B在肿瘤中的高表达与差的临床预后相关联。
[0005]肿瘤细胞中持续的APOBEC3B活性能促使肿瘤组织分支进化与耐药性克隆产生。在非小细胞肺癌中，晚期的细胞克隆中能检测到APOBEC酶对肺癌驱动基因（如PTPRD、EP300及TGFBR1等）的突变，而在头颈癌中，APOBEC3B异常激活则能产生PIK3CA螺旋结构域突变（E542/545L）。这些结果预示了常见的原癌基因或药物靶点能成为APOBEC3B的编辑对象。在ER阳性乳腺癌中，APOBEC3B的高表达与较差的辅助疗法效能相关联，并且是他莫昔芬疗法耐药性产生的原因，因此APOBEC3B是一个经过初步验证的抗肿瘤药物耐药性产生靶标。
[0006]鉴于APOBEC3B在癌症发生发展中的重要作用，发掘能够检测APOBEC3B活性的技术手段，并将其应用于APOBEC3B抑制剂筛选，以期筛选出能有效抑制APOBEC3活性的化合物；以及应用于组织/细胞中APOBEC3B含量的检测，辅助进行医学诊断，以上目的具有重要意义。
[0007]当前对APOBEC3B活性检测的手段不多，主要包括PAGE凝胶电泳、核磁滴定、表面等
离子体共振技术、等温滴定量热法等手段，这些手段存在着操作繁琐、耗时、价格高昂、原材料用量大等缺点。目前已报道一种基于FRET效应与UDG酶参与的APOBEC3B生物传感器，并且已经应用于APOBEC3B抑制剂高通量筛选。但遗憾的是，通过该生物传感器筛选出的APOBEC3B抑制剂，大部分实际上为抑制UDG酶活性的假阳性抑制剂。因此，设计出一个方便快捷、价格较低、原材料用量小且能避免筛选出假阳性抑制剂的试剂盒是一个十分有前景的想法。

技术实现思路

[0008]为了解决上述现有技术存在的不足和缺点，本专利技术的目的在于提供一种单链DNA，以及一种用于检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B的试剂盒及其应用。
[0009]本专利技术通过设计合成一段带有APOBEC3B识别位点5
’‑
TCA的单链DNA，该单链DNA的5
’
端被荧光基团修饰，3
’
端被淬灭基团修饰，该单链DNA与APOBEC3B共同孵育，胞嘧啶C会在APOBEC3B的作用下被突变为尿嘧啶U，这时加入能在5
’‑
TCA处断裂该单链DNA的限制性内切酶BspH
ꢀⅠ
，由于上述突变，该单链DNA无法被酶切，保持完整，此时激发荧光基团，由于FRET效应，荧光基团会被淬灭；如果APOBEC3B活性被抑制，BspH
ꢀⅠꢀ
酶将会在5
’‑
TCA处切开该单链DNA，荧光基团和淬灭基团分离，此时激发荧光，荧光基团将被激发并发出对应荧光。
[0010]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种单链DNA，所述单链DNA带有核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B识别位点，所述核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B识别位点能够被限制性核酸内切酶识别后切开，所述单链DNA的5
’
端被荧光基团修饰，3
’
端被淬灭基团修饰。
[0011]优选地，所述核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B识别位点为5
’‑
TCA，所述限制性核酸内切酶为能在5
’‑
TCA处切开所述单链DNA的限制性内切酶BspH
ꢀⅠ
。
[0012]优选地，所述单链DNA的序列如SEQ ID NO:1所示；所述荧光基团包括FAM、TET、JOE、HEX、CY3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、CY5和LC RED705中的至少一种，所述淬灭基团包括FAM、TET、JOE、HEX、CY3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、CY5、LC RED705、BHQ1、BHQ2、BHQ3和DABCYL中的至少一种。
[0013]本专利技术提供了一种用于检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B的试剂盒，所述试剂盒包括上述所述的单链DNA，所述单链DNA的互补链、限制性核酸内切酶BspH
ꢀⅠ
，以及缓冲液。
[0014]优选地，所述缓冲液为第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液或第四缓冲液；所述第一缓冲液包括10
–
50 mM CH3COOK, 10
‑
100 mM Tris
‑
acetate，10
‑
100 mM本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单链DNA，其特征在于，所述单链DNA带有核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B识别位点，所述核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B识别位点能够被限制性核酸内切酶识别后切开，所述单链DNA的5
’
端被荧光基团修饰，3
’
端被淬灭基团修饰。2.根据权利要求1所述的单链DNA，其特征在于，所述核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B识别位点为5
’‑
TCA，所述限制性核酸内切酶为能在5
’‑
TCA处切开所述单链DNA的限制性内切酶BspH
ꢀⅠ
。3.根据权利要求1所述的单链DNA，其特征在于，所述单链DNA的序列如SEQ ID NO:1所示；所述荧光基团包括FAM、TET、JOE、HEX、CY3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、CY5和LC RED705中的至少一种，所述淬灭基团包括FAM、TET、JOE、HEX、CY3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、CY5、LC RED705、BHQ1、BHQ2、BHQ3和DABCYL中的至少一种。4.一种用于检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1
‑
3任一所述的单链DNA，所述单链DNA的互补链、限制性核酸内切酶BspH
ꢀⅠ
，以及缓冲液。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液或第四缓冲液；所述第一缓冲液包括10
–
50 mM CH3COOK, 10
‑
100 mM Tris
‑
acetate，10
‑
100 mM (CH3COO)2Mg，0.1
‑
10 μg/mL BSA, pH 5
‑
8；所述第二缓冲液包括50
‑
150 mM NaCl, 10...

【专利技术属性】
技术研发人员：张艺瀚，卢宇靖，郭晓纯，钟家本，方志远，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：