一种肠癌检测试剂及其在肠癌检测中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种肠癌检测试剂及其制备方法，检测试剂由以下试剂混合而成，试剂A：浓度为10mM的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度0.5～5％的SDS配制而成；试剂B：由0.01～10U/10μL糖胺酰酶和0.01～10U/10μL唾液酸酶混合配制而成，混合溶液pH值为4～9；试剂C：由8

【技术实现步骤摘要】
一种肠癌检测试剂及其在肠癌检测中的应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及一种肠癌的检测方法，具体涉及一种基于血清糖蛋白寡糖链检测(G
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Test)特异指纹图谱的肠癌检测方法。

技术介绍

[0002]肠癌(Carcinomaofrectum)是常见的恶性肿瘤，包括结肠癌和直肠癌。肠癌的发病率从高到低依次为直肠、乙状结肠、盲肠、升结肠、降结肠及横结肠，近年有向近端(右半结肠)发展的趋势，其发病与生活方式、遗传、大肠腺瘤等关系密切。肠癌发病年龄趋老年化，男女之比为1.65：1。肠癌的发生与高脂肪低纤维素饮食、大肠慢性炎症、大肠腺瘤、遗传因素和其他因素如：血吸虫病、盆腔放射、环境因素(如土壤中缺钼)、吸烟等有关。肠癌早期无症状，或症状不明显，仅感不适、消化不良、大便潜血等。随着癌肿发展，症状逐渐出现，表现为大便习惯改变、腹痛、便血、腹部包块、肠梗阻等，伴或不伴贫血、发热和消瘦等全身症状。肿瘤因转移、浸润可引起受累器官的改变。大肠癌因其发病部位不同而表现出不同的临床症状及体征：1.右半结肠癌；2.左半结肠癌；3.直肠癌；4.肿瘤浸润及转移症。肠癌晚期常侵犯周围组织器官，如膀胱和前列腺等邻近组织，引起尿频、尿急和排尿困难。侵及骶前神经丛，出现骶尾和腰部疼痛。直肠癌还可以向远处转移到肝脏，引起肝肿大，腹水、黄疸，甚至恶液质等表现。另外在结直肠癌手术并发症中，还有输尿管损伤、造口坏死及腹内疝等。
[0003]肠癌临床诊断主要有肠指检、肠镜检、病理学检查、癌胚抗原(CEA)测定、气钡灌肠对比造影、B超检查、端粒酶活性检测、肠癌电子计算机断层扫描(CT)检测、核磁共振成像(MRI)检查等。肿瘤标记物癌胚抗原(CEA)检测，虽然有助于肿瘤的诊断。但是由于CEA的组织特异性不高，其它组织的疾病也会引起CEA升高。在大肠癌患者中，CEA水平高并不表示均存在远处转移；有少数转移瘤患者，CEA并不增高。CEA检查不具有特异性的诊断价值，具有一定的假阳性和假阴性，因此不适合作为普查或早期诊断，但对估计预后观察疗效和复发方面具有一定帮助。据统计目前直肠癌误诊率高达百分之六十以上，所以急需高灵敏度，高特异度的新生物标志物进行无创快速的诊断方法来辅助早期诊断。
[0004]蛋白质的糖基化(Glycosylation)是一种最常见的蛋白翻译后修饰，是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质和蛋白质上特殊的氨基酸残基形成糖苷键的过程。大多数的糖蛋白都是分泌蛋白，广泛存在于细胞膜、细胞间质、血浆以及粘液中。有些酶和激素是糖蛋白。糖蛋白具有多种生物功能。有些糖蛋白如原胶原是结构蛋白质。许多酶和激素(如黄体生成素、促甲状腺激素等)有糖蛋白结构，血液中的许多糖蛋白担负无机离子(Fe2+、Ca2+、Cu2+等)和激素等生物活性物质的运输，血液凝固(纤维蛋白原是糖蛋白)和抗体活性等生物功能。凝集素有凝集细胞的能力，糖链还可起稳定肽链的作用。糖蛋白的另一重要功能是直接或间接地参与细胞表面的种种识别现象。由于糖蛋白中糖链对于维持机体生物学功能的重要性，糖链的改变有助于阐明炎症、肿瘤细胞对周围组织侵袭及转移等异常生物行为学的分子机理。目前，己经在多种肿瘤中发现了N
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糖链的改变。
[0005]糖链是重要的生物信息分子，在许多生理和病理过程中都发挥着独特作用。糖链
结构非常复杂，具有微观不均一性，其分析和结构解析一直是糖生物学研究的瓶颈。目前糖链结构的分析方法发展迅速，主要包括(1)高效液相色谱法(HPLC)：分辨率高，检测速度快，重复性高，高效液相色谱柱可以反复使用，但是柱效会随着使用次数的增加而变低，且流动相有毒，设备操作需要受过严格培训的专业人才进行，且设备相对昂贵，溶剂需要严格纯化；(2)质谱法(MS)：质谱具有灵敏度高、可获得多种结构信息和适于分析混合物等优点，是糖链定性定量分析的一种理想手段。但是质谱仪器精密，设备操作复杂，且质谱仪价格昂贵，不适合临床上普及推广使用；(3)毛细管电泳法(CE)：毛细管电泳成本低、柱效高、灵敏度高、速度快、进样量少、操作简单，但是重复性不高，稳定性不如HPLC。
[0006]G
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Test检测法(Glycan
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Test)是基于DNA分析仪的毛细管微电泳技术(DSA
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FACE)，将前列腺液样本中糖蛋白的N
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糖链进行荧光标记后，用毛细管微电泳进行分离，通过测量荧光信号得到的N
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寡糖链的含量即指纹图谱(简称G
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Test图谱)。该检测技术具有灵敏度高、操作简单、微量(2μL血清)、重复性高、稳定性好、高通量(96
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孔板)等其他糖链分析技术无法比拟的优点，适用于一般检验科室，可望用于临床推广使用。
[0007]本专利技术申请血清G
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Test糖组学检测技术正好满足这些条件，因此具有良好的应用前景。

技术实现思路

[0008]本专利技术目的在于提供一种肠癌检测试剂，通过该试剂测定血清中的糖组图谱，将峰值量化，进行统计学分析，从而提供一种肠癌的血清糖组图谱模型的建立方法。
[0009]本专利技术采用的技术方案如下：
[0010]一种肠癌检测试剂，由以下试剂组成：
[0011]试剂A：浓度为10mM的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度0.5～5％的SDS配制而成；
[0012]试剂B：由0.01～10U/10μL糖胺酰酶和0.01～10U/10μL唾液酸酶混合配制而成，混合溶液pH值为4～9；
[0013]试剂C：由8
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氨基芘
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1,3,6
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三磺酸溶于DMSO中配制而成，浓度为0.01mM～1M；
[0014]试剂D：终止液。
[0015]优选地，所述试剂A、试剂B与试剂C的体积比为2：2：1。
[0016]一种肠癌检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
[0017]步骤一 寡糖链的制备
[0018]在经过灭活处理的2μL血清样品中加入4μL试剂A，进行变性，降温到室温后，加入4μL试剂B，孵育1～6h；
[0019]步骤二 寡糖链的标记
[0020]在步骤一得到的液体中加入2μL试剂C，进行荧光标记，然后加入150μL试剂D终止标记反应；
[0021]步骤三 寡糖链分离分析
[0022]取10μL步骤二处理后的液体，用分析仪进行糖链分离，得到图谱。
[0023]优选地，所述步骤一寡糖的制备中变性温度为不低于75℃加热，孵育温度为不低于25℃。
[0024]优选地，所述步骤二中荧光标记的温度为50～90℃。
[0025]一种组合物在肠癌检测试剂中的应用，所述组合物通过(NG1A2F+NA3)/NA2FB的比值来检测肠癌。
[0026]本专利技术提供一种肠癌的血清糖蛋白N
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糖组图谱模型的建立方法，通过测定血清糖蛋白寡糖链G
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肠癌检测试剂，其特征在于，由以下试剂组成：试剂A：浓度为10mM的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度0.5～5％的SDS配制而成；试剂B：由0.01～10U/10μL糖胺酰酶和0.01～10U/10μL唾液酸酶混合配制而成，混合溶液pH值为4～9；试剂C：由8
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氨基芘
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1,3,6
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三磺酸溶于DMSO中配制而成，浓度为0.01mM～1M；试剂D：终止液。2.根据权利要求1所述的肠癌检测试剂，其特征在于，所述试剂A、试剂B与试剂C的体积比是2：2：1。3.根据权利要求1所述的肠癌检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一寡糖链的制备在经过灭活处理的2μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈翠英，王蕾，谈宗男，
申请(专利权)人：陈翠英，
类型：发明
国别省市：