适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法及应用，检测方法，包括如下步骤：引物探针设计：基于结直肠转录表达资源，选择了若干管家基因作为候选基因，并分别设计引物和探针，候选管家基因至少包括GAPDH和/或SDHA；反转录：针对目标样本和/或对照样本，提取RNA，反转录为对应的cDNA，本发明专利技术通过选择设计了适用于结直肠组织和/或肿瘤的特定的引物和探针，经实验测试证明具有更为良好的检测稳定性，无论在针对细胞系(含原代细胞)或者临床组织样本的检测中都具有明显的应用优势。组织样本的检测中都具有明显的应用优势。组织样本的检测中都具有明显的应用优势。

【技术实现步骤摘要】
适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法及应用


[0001]本专利技术是关于生物检测
，特别是关于一种适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法及应用。

技术介绍

[0002]结直肠是人体消化道对营养物质做最后一次吸收的地方，是人体把食物残渣变成粪便，排除体外的器官。结肠包括升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠四个部分。大多数结直肠癌是由息肉引起，最终发展为结直肠癌，整个过程可长达5
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15年。全球范围内，结直肠癌是第三位最常见的恶性肿瘤，也是第二位最常见的恶性肿瘤死亡原因。据WHO癌症研究中心的GLOBOCAN项目估计，2018年全球范围内结直肠癌新发病例数约为180万，死亡人数约为88万。
[0003]近年的研究表明，结直肠癌是一类多基因病，其发展过程复杂，临床表现多样，涉及到多个基因的变化，其发生与某些原癌基因的激活和抗癌基因的失活有关。结直肠癌病人基因组的异质性决定了每个病人对药物的不同反应性。基因组异质性指的是每个病人基因组的突变基因类型和数目、基因(或染色体片段)拷贝数变异、融合基因类型和基因表达水平等不完全相同。这些性质的不同导致“同治不同效”。要精确找到病人对哪种药物可能敏感，首先要了解病人基因组的各类信息，尤其是基因突变和表达异常；之后通过测序技术和生物信息学分析，推测关键靶标基因，选择所对应的药物，用于病人临床治疗。现有的胃肠靶向检测技术，如一种HER2检测试剂盒及其检测方法和应用(CN201910476081.5)、用于胃癌诊断及预后评估的生物标记物及应用和检测试剂盒(CN202010197122.X)和METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物治疗敏感性的试剂盒中的应用(CN202010424466.X)均选用了GAPDH作为内参对照等，在稳定性和检测准确性均有待提高。
[0004]公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法及应用，通过选择设计了特定的引物和探针，具有更为良好的检测稳定性，无论在针对细胞系或者临床组织样本的检测中都具有明显的应用优势。
[0006]为实现上述目的，本专利技术的实施例提供了适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法，包括如下步骤：引物探针设计：基于结直肠转录表达资源，选择了若干管家基因作为候选基因，并分别设计引物和探针，所述管家基因至少包括GAPDH和/或SDHA；反转录：针对目标样本和/或对照样本，提取RNA，反转录为对应的cDNA，所述目标细胞样本选自结直肠癌细胞系细胞、保存在RNAlatter溶液中的新鲜肿瘤组织样本、经液氮速冻且
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80℃保存的肿瘤组织样本、经福尔马林固定后的肿瘤组织样本，所述对照细胞样本选自健康人的白细胞、保存在RNAlatter溶液中的新鲜正常组织样本、经液氮速冻且
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80℃冻存的正常组织样
本、经福尔马林固定后的正常组织样本。实时荧光定量PCR检测：在包括有所述引物、探针和cDNA的PCR反应体系中扩增反应，其中内参基因为SDHA，表达检测。优选的，其中内参基因为SDHA时表达检测结果相对其它候选管家基因最为稳定。
[0007]在本专利技术的一个或多个实施方式中，针对GAPDH，所述引物和探针包括：正向引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；反向引物核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；探针核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0008]在本专利技术的一个或多个实施方式中，针对GAPDH，所述探针核苷酸序列的5
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端还标记有荧光报告基团，3
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端还标记有荧光淬灭基团。
[0009]在本专利技术的一个或多个实施方式中，针对SDHA，所述引物和探针包括：正向引物核苷酸序列如SEQ ID No.4或7所示；反向引物核苷酸序列如SEQ ID No:5或8所示；探针核苷酸序列如SEQ ID No.6或9所示。
[0010]在本专利技术的一个或多个实施方式中，针对SDHA，所述探针核苷酸序列的5
’
端还标记有荧光报告基团，3
’
端还标记有荧光淬灭基团。
[0011]在本专利技术的一个或多个实施方式中，荧光报告基团为FAM、HEX、VIC、ROX、Cy5中的至少一种，荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2、MGB中的至少一种。
[0012]在本专利技术的一个或多个实施方式中，结直肠癌细胞系细胞至少包括DLD
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1、HCT116，具有显而易见的细胞系和原代细胞推广能力；组织样本包括保存在RNAlatter溶液中的肿瘤和正常样本、经液氮速冻且
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80℃冻存的肿瘤和正常样本、经福尔马林固定后的肿瘤和正常样本；
[0013]在本专利技术的一个或多个实施方式中，PCR反应体系为qpcrmastermix(2X)10μL，cDNA 1μL，primerF 1μL，primer R 1μL，probe 0.5μL，超纯水6.5μL。
[0014]在本专利技术的一个或多个实施方式中，扩增反应的条件为：95℃热激活3分钟；95℃变性15秒，60℃退火40秒,共进行40个循环.
[0015]在本专利技术的一个或多个实施方式中，应用，应用了如前述的适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法的荧光定量PCR设备或数字PCR设备或荧光探针检测设备。
[0016]本专利技术方案可以被应用于荧光定量PCR、数字PCR、荧光探针检测等。
[0017]与现有技术相比，根据本专利技术实施方式的适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法及应用，基于TCGA和GTEx的结直肠转录表达资源，评估了常见的管家基因GAPDH、SDHA，数据显示内参基因SDHA在不同样本间表达稳定；而GAPDH在该队列的肿瘤组织和正常组织间表达存在显著差异。细胞系实验中，SDHA的Ct值变异系数小于GAPDH，且SDHA在肿瘤和正常组织间波动差异也小于GAPDH。组织学实验数据证明，在取自临床的正常组织样本和肿瘤样本中，相对GAPDH，SDHA样本间表达差异最小，相对稳定性最高。
[0018]综上所述，SDHA作为内参基因，在结直肠组织和/或肿瘤中表达稳定，基于SDHA表达值进行校正能够提高结直肠肿瘤样本和正常样本中其它目标基因的定量可靠性，进一步提高后期相关结直肠癌检测的灵敏度和特异性。本专利技术检测方法简单，操作便捷，大大提高了检测的灵敏度和特异性及定量可靠性。
附图说明
[0019]图1是本专利技术实施例1中基于队列转录组数据进行的目标内参基因在肿瘤和正常
组织表达对比分析。
具体实施方式
[0020]下面结合本专利技术的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。
[0021]除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法，其特征在于，包括如下步骤：引物探针设计：基于结直肠转录表达资源，选择了若干管家基因作为候选基因，并分别设计引物和探针，所述管家基因选自GAPDH、SDHA；反转录：针对目标样本和/或对照样本，提取RNA，反转录为对应的cDNA，所述目标样本选自结直肠癌细胞系细胞、保存在RNA latter溶液中的新鲜肿瘤组织样本、经液氮速冻且
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80℃保存的肿瘤组织样本、经福尔马林固定后的肿瘤组织样本，所述对照样本选自健康人的白细胞、保存在RNA latter溶液中的新鲜组织样本、经液氮速冻且
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80℃冻存的组织样本、经福尔马林固定后的组织样本；实时荧光定量PCR检测：在包括有所述引物、探针和cDNA的PCR反应体系中扩增反应。2.如权利要求1所述的适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法，其特征在于，针对GAPDH，所述引物和探针包括：正向引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；反向引物核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；探针核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。3.如权利要求2所述的适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法，其特征在于，针对GAPDH，所述探针核苷酸序列的5
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端还标记有荧光报告基团，3
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端还标记有荧光淬灭基团。4.如权利要求1所述的适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法，其特征在于，针对SDHA，所述引物和探针包括：正向引物核苷酸序列如SEQ ...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴文韬，惠薇，刘佳，卞振昌，丁国徽，
申请(专利权)人：苏州睿明医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：