EGFR基因突变多重检测引物探针及其试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种EGFR基因突变多重检测引物探针及其试剂盒包括检测EGFR基因20号外显子T790M突变的上游引物F

【技术实现步骤摘要】
EGFR基因突变多重检测引物探针及其试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种EGFR基因突变检测产品，属于生物


技术介绍

[0002]EGFR基因的突变在几种癌症类型中很常见，而且这些突变往往会导致表达和活性的改变。这种类型的激活突变经常发生在上皮性癌症，特别是肺癌和胶质母细胞瘤，也是我国肺腺癌发生的主要驱动基因。肺癌在所有恶性肿瘤中的发病率和死亡率位居首位，非小细胞肺癌(NSCLC)是世界上最常见的癌症之一，经常与EGFR的突变有关。EGFR的上调和过表达可导致不受控制的细胞分裂，导致组织恶性生长并导致癌症。一个常见的例子是EGFR第21外显子中的一个点突变(c.2573T>G)，通常被称为L858R变异，另一种高频突变是EGFR突变是位于第19外显子的高度可变缺失。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)已被证明对治疗具有EGFR激活突变的非小细胞肺癌(NSCLC)患者有效。然而，大多数应答者最终对EGFR
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TKIs产生了获得性耐药性，其中，在近一半对EGFR
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TKIs耐药的病例中观察到继发性错义T790M突变。
[0003]在过去的40年里，非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗取得了巨大的进展。致癌驱动因子如EGFR(表皮生长因子受体)的发现，使癌症治疗的一个新的、越来越有效的阶段成为可能。由于空间和时间的异质性，使用初始组织样本的分子检测方法不适合在整个治疗过程中进行治疗指导，特别是在疾病进展后。癌症组织通常是高度异质性的，癌症生物标志物在疾病类型和疾病进展阶段而不同，这使早期阶段的癌症检测和识别复杂化。因此，在其他易于动态获得的标本中研究了检测突变的方法，如使用血浆、胸膜液和痰等标本。血浆细胞游离DNA(cfDNA)作为一种液体活检，被研究作为一种潜在的有价值的检测肿瘤特异性畸变的替代标本。使用cfDNA进行肿瘤突变检测的优点包括i)无创收集，ii)病程中任何时间的可用性，iii)实时检测和动态监测与肿瘤组织检测相比，异质性问题可能更少。事实上，cfDNA中的EGFR激活突变状态已被证明能够预测EGFR
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TKI治疗NSCLC的疗效。然而，在检测cfDNA检测肿瘤EGFR突变方面仍存在技术挑战。来自个体患者的cfDNA的存在和/或浓度可能是可变的，而且通常往往较低。cfDNA片段相对较小，峰值大小约为180bp。肿瘤来源的DNA部分在总cfDNA中的百分比是单独可变的，往往太低，无法检测。最后，既往研究报道，与肿瘤组织检测相比，cfDNA中EGFR突变检测的敏感性仅为43％～66％。因此，开发一种具有高灵敏度的基于cfDNA的EGFR突变检测方法具有重要意义。
[0004]聚合酶链反应(PCR)的专利技术改变了生命科学的研究和分子诊断。现在，数字PCR(dPCR)正在改变传统PCR的领域，并重新定义了对突变检测的检测下线。对于许多检测方法，dPCR的敏感度明显高于传统的PCR分析，并且通过单独计数更多的分子，提高了检测方法的准确性和精度。数字PCR的敏感性将会提高检测限制重新定义了我们对疾病发病、进展和复发的理解。数字PCR的一个特别有吸引力的应用是在大量野生型分子中定量检测少量的突变DNA分子，这与癌症研究有关，特别是与次要等位基因的检测有关。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种快速高效，检测体系的特异性与灵敏度高，游离DNA的利用率高，准确度高的EGFR基因突变多重检测引物探针，以及采用该引物探针的试剂盒。
[0006]本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种EGFR基因突变多重检测引物探针，包括检测EGFR基因20号外显子T790M突变的上游引物F
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T790M、下游引物R
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T790M、野生型探针WP
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T790和突变型探针MP
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T790M，检测EGFR基因21号外显子L858R突变的上游引物F
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L858R、下游引物R
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L858R、野生型探针WP
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L858和突变型探针MP
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L858R，以及检测EGFR基因19号外显子片段缺失突变的上游引物F
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E19del、下游引物R
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E19del、野生型探针WP
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E19和突变型探针MP
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E19del；
[0007]所述上游引物F
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T790M的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物R
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T790M的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述野生型探针WP
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T790的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述突变型探针MP
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T790M的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
[0008]所述上游引物F
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L858R的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述下游引物R
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L858R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述野生型探针WP
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L858的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述突变型探针MP
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L858R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
[0009]所述上游引物F
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E19del的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述下游引物R
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E19del的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，所述野生型探针WP
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E19的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，所述突变型探针MP
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E19del的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。
[0010]上述突变型探针MP
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T790M的使用浓度为30nM，所述突变型探针MP
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L858R的使用浓度为10nM，所述突变型探针MP
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E19del的使用浓度为50nM。所有引物的使用浓度为50nM。所有野生型探针的使用浓度为20nM。
[0011]所有野生型探针和突变型探针为经过修饰的MGB探针，所有野生型探针的5
’
端为VIC荧光基团修饰，所有突变型探针的5
’
端为FAM荧光基团修饰，所有突变型探针的3
’
端为NFQ基团修饰。
[0012]本专利技术为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种采用上述引物探针的EGFR基因突变多重检测试剂盒。
[0013]上述EGFR基因突变多重检测试剂盒还包括带有EGFR基因T790M突变的质粒，带有EGFR基因L858R突变的质粒，以及带有EGFR基因19号外显子片段缺失的E19del突变的质粒。
[0014]本专利技术具有积极的效果：
[0015](1)本专利技术的EGFR基因突变多重检测产品的标准品是用酶切后的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种EGFR基因突变多重检测引物探针，其特征在于：包括检测EGFR基因20号外显子T790M突变的上游引物F
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T790M、下游引物R
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T790M、野生型探针WP
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T790和突变型探针MP
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T790M，检测EGFR基因21号外显子L858R突变的上游引物F
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L858R、下游引物R
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L858R、野生型探针WP
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L858和突变型探针MP
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L858R，以及检测EGFR基因19号外显子片段缺失突变的上游引物F
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E19del、下游引物R
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E19del、野生型探针WP
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E19和突变型探针MP
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E19del；所述上游引物F
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T790M的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物R
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T790M的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述野生型探针WP
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T790的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述突变型探针MP
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T790M的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述上游引物F
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L858R的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述下游引物R
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L858R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述野生型探针WP
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L858的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述突变型探针MP
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L858R的核苷酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪专，潘文健，
申请(专利权)人：普瑞斯新上海生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：