一种基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法技术

本发明专利技术公开了一种基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法，本发明专利技术涉及分子生物学领域，涉及核酸扩增以及生物检测领域，包括以下步骤；将单链DNA进行硫代修饰，再进行环化；使单链环状DNA与包含DNA聚合酶、分子拥挤剂、脱氧核糖核苷三磷酸和具有3'末端和5'末端的引物的反应溶液接触；经由滚环扩增来扩增所述单链环状DNA以形成扩增的DNA产物，包括六聚体随机引物设计、快速检测体系配制、一管式扩增检测方法，本发明专利技术引物设计为非特异性引物，六聚体随机引物理论上能够结合环型模板的任意位点，从而相比传统的滚环扩增检测具有超高扩增效率，对扩增靶标的选择性广，本方法可为常规核酸检测提供技术方法，具有广泛的潜在应用前景。景。景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，涉及核酸扩增以及生物检测领域，具体为一种基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法。

技术介绍

[0002]滚环扩增技术是一种简单的恒温DNA扩增技术，在DNA聚合酶(Phi29)的催化下通过扩增闭合环状模板产生成千上万的重复序列。相较于变温核酸扩增技术如聚合酶链式反应，RCA不需要昂贵的变温仪器，更适合现场检测。RCA借鉴了微生物种环状DNA复制方式。以phi29DNA聚合酶，在30
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37℃左右进行扩增。普通RCA的过程为：引物与环状DNA模板结合后延伸，生成含有大量目的基因的DNA单链。在此基础上，近年来还发展出了多种改进技术，如多位点同时进行扩增的多引物RCA、使用两条引物提高扩增效率的指数RCA，RCA在应用上也十分广泛，通过RCA扩增产物与互补的寡核苷酸结合，包括荧光染料、电化学标签、生物素、抗体、酶和纳米粒子。
[0003]尽管RCA扩增在DNA、RNA检测领域应用十分广泛。但在扩增效率方面仍然不足，且往往需要特异性引物触发扩增反应，无法满足使用者需要，使用随机引物结合phi29DNA聚合酶对环状DNA模板扩增，可以10
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30分钟内达到凝胶可见的扩增量，扩增2h，RCA扩增产物能够达到絮凝胶状。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法，具备了通过设置引物设计为非特异性引物，六聚体随机引物理论上能够结合环型模板的任意位点，从而引发高效的扩增反应，并且灵敏度高以及对样本的要求低的效果，解决了RCA扩增虽然在DNA、RNA检测领域应用十分广泛，RCA扩增在扩增效率方面仍然不足，且往往需要特异性引物触发扩增反应，无法满足使用者需要的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法，包括以下步骤：
[0006]步骤S1：将单链DNA进行硫代修饰，然后将单链DNA进行环化，得到硫代修饰的单链环状DNA；
[0007]步骤S2：使单链环状DNA与包含DNA聚合酶、分子拥挤剂、脱氧核糖核苷三磷酸和具有3'末端和5'末端的引物的反应溶液接触；
[0008]步骤S3：经由滚环扩增来扩增所述单链环状DNA以形成扩增的DNA产物，滚环扩增温度为30℃，扩增时间为1小时。
[0009]可选的，所述步骤S2中引物是六聚体，所述六聚体具有(atN)(atN)(atN)(atN)(atN)*N的通用结构，其中(atN)为所述六聚体的5'端核苷酸且*N为所述六聚体的3'端核苷酸，且其中“N”代表脱氧腺苷(dA)、脱氧胞苷(dC)、脱氧鸟苷(dG)或脱氧胸苷(dT)，(atN)代表2
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氨基
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dA、dC、dG和2
‑
硫
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dT的随机混合物，且“*”代表硫代磷酸酯键。
[0010]可选的，所述步骤S2中分子拥挤剂选自PEG400、PEG2000、PEG6000、PEG8000或其组合，所述DNA聚合酶为Phi29DNA聚合酶。
[0011]可选的，所述步骤S1中所述单链环状DNA的浓度为5～50nM，所述单链DNA的长度为30～90nt。
[0012]可选的，所述步骤S3中滚环扩增包括一种含硫修饰的六聚体随机引物SEQIDNO.1，RCA反应buffer组成：10mMTris
‑
HCl，2mMMgCl2，2mM(NH4)2SO4，0.8mMDTT，2mMdNTP，4mg/mlBSA，2uM6Ns(pH7.5@25℃)。
[0013]可选的，还包括一种环化、扩增、检测一管式的高效检测方法，包括不同的buffer成份配制，PH，环化、扩增和检测的时间。
[0014]可选的，包括一体化的bufferMix体系2
×
OnepotbufferMix：10mMTris
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HCl，2mMMgCl2，2mM(NH4)2SO4，0.8mMDTT，2mMdNTP，4mg/mlBSA，2uM6Ns，120μlMATP(pH7.5@25℃)；所述一体化检测时间为1.5h；所述扩增的程序为step1：37℃，1min；step2：37℃，30s；step3：37℃，30s(收集一次荧光信号)，gotostep2，循环数为90，阴性对照为无菌超二纯水。
[0015]可选的，所述步骤S2中对单链环状DNA进行变性处理，变性处理的体系中含有浓度为0.05mM的EDTA；变性处理包括将单链环状DNA加热到95℃保持3分钟，然后降温到4℃并保持。
[0016]可选的，所述步骤S3中在滚环扩增结束后，用BamH1
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HF内切核酸酶在37℃处理扩增产物1小时。
[0017]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
[0018]一、本专利技术相比传统的滚环扩增技术具有灵敏度高，扩增高效，以及对样本的要求低，特别在对低拷贝数和痕量样本具有重要意义。
[0019]二、本专利技术通过设置引物设计为非特异性引物，六聚体随机引物理论上能够结合环型模板的任意位点，从而引发高效的扩增反应。
[0020]三、本专利技术通过对单链环状DNA进行变性处理，变性处理过程中的高温可保证初始模板DNA的充分释放，降温过程可让随机引物和环状DNA模板退火结合。
附图说明
[0021]图1为本专利技术六聚体滚环扩增示意图；
[0022]图2为本专利技术APACE检测引物探针序列表；
[0023]图3为本专利技术实施例中MCRCA扩增和6NRCA扩增产物比对；1表示MCRCA，2表示6NRCA，3阳性，4表示ddH2O；
[0024]图4为本专利技术MCRCA和6NRCA扩增产物荧光检测图；
[0025]图5为本专利技术一管式滚环扩增结合CRISPR
‑
FnCpf1检测图。
具体实施方式
[0026]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0027]下列实施实例中，具体实验条件按照本领域内参考文献或者试剂盒使用说明书进行，所用仪器和耗材，若无特别说明生产厂家者，可根据自身实验室条件按市售渠道获得。
[0028]请参阅图1至图5，本实施例中提供一种基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法，包括以下步骤：
[0029]步骤S1：将单链DNA进行硫代修饰，然后将单链DNA进行环化，得到硫代修饰的单链环状DNA；
[0030]步骤S2：使单链环状DNA与包含DNA聚合酶、分子拥挤剂、脱氧核糖核苷三磷酸和具有3'末端和5'末端的引物的反应溶液接触；
[0031]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法，包括以下步骤：步骤S1：将单链DNA进行硫代修饰，然后将单链DNA进行环化，得到硫代修饰的单链环状DNA；步骤S2：使单链环状DNA与包含DNA聚合酶、分子拥挤剂、脱氧核糖核苷三磷酸和具有3'末端和5'末端的引物的反应溶液接触；步骤S3：经由滚环扩增来扩增所述单链环状DNA以形成扩增的DNA产物，滚环扩增温度为30℃，扩增时间为1小时。2.根据权利要求1所述的基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法，其特征在于：所述步骤S2中引物是六聚体，所述六聚体具有(atN)(atN)(atN)(atN)(atN)*N的通用结构，其中(atN)为所述六聚体的5'端核苷酸且*N为所述六聚体的3'端核苷酸，且其中“N”代表脱氧腺苷(dA)、脱氧胞苷(dC)、脱氧鸟苷(dG)或脱氧胸苷(dT)，(atN)代表2
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氨基
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dA、dC、dG和2
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硫
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dT的随机混合物，且“*”代表硫代磷酸酯键。3.根据权利要求1所述的基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法，其特征在于：所述步骤S2中分子拥挤剂选自PEG400、PEG2000、PEG6000、PEG8000或其组合，所述DNA聚合酶为Phi29DNA聚合酶。4.根据权利要求1所述的基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法，其特征在于：所述步骤S1中所述单链环状DNA的浓度为5～50nM，所述单链DNA的长度为30～90nt。5.根据权利要求1所述的基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法，其特征在于：所述步骤S3中滚环扩增包括一种含硫修饰的六聚体随机引物SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁国武，杨立桃，
申请(专利权)人：杭州飞时达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：