本发明专利技术公开了一种基因敲除型杆状病毒表达载体。该载体通过同时敲除相邻的杆状病毒非必需基因Ac68、Ac69、Ac70、Ac71和Ac72，使外源蛋白表达水平显著提高。同时，病毒的增殖特性未见显著变化。表达产量的提高能降低企业的生产成本，敲除大段基因能使载体容量增加。该杆状病毒表达载体可用于生物制品工业领域，特别是亚单位疫苗工业领域。是亚单位疫苗工业领域。是亚单位疫苗工业领域。
【技术实现步骤摘要】
一种Ac68
‑
72敲除的杆状病毒表达载体
[0001]本专利技术属于重组蛋白质表达
，尤其涉及一种基因敲除的杆状病毒表达载体。
技术介绍
[0002]杆状病毒是特异感染节肢动物的双链DNA病毒，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica nucleopolyhedrovirus, AcMNPV）是杆状病毒的模式种。自从1983年Smith GE等首次用杆状病毒在昆虫细胞中表达人β
‑
干扰素基因以来（Mol Cell Biol. 1983; 3:2156
‑
65.），由于具有低成本、高产量，而且具备各种翻译后修饰系统等优点，杆状病毒表达载体系统在科研和生产中被广泛应用。
[0003]但相较于工业上普遍使用的原核表达系统（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌）和酵母表达系统，杆状病毒表达载体系统的产量还不尽人意。为此人们采取了多种策略提高该表达系统的产量，这些策略包括：1、改造启动子及周边元件。比如通过串联p6.9和p10启动子可以将GFP产量提高4.4倍（PLoS ONE. 2014; 9(5): e96562.）；在polh启动子下游重复一次Burst sequence可以使GUS酶活提高1.5倍（Biotechnol Bioeng. 2010; 107:909
‑
16.）。
[0004]2、构建抗凋亡载体或细胞系。用RNA干扰载体在昆虫细胞Sf9中表达Sf
‑
caspase
‑<br/>1的dsRNA，可以成功沉默细胞中的Sf
‑
caspase
‑
1，使外源蛋白的产量显著提高（Biotechnol Appl Biochem. 2007; 48: 11
‑
19.）。张潇月等将靶向Sf
‑
caspase
‑
1的双链小RNA编码序列直接克隆到杆状病毒基因组上，使表达的荧光素酶活性提高10倍（BMC Biotechnol. 2018; 18:24.）。
[0005]3、敲除非必需基因。比如敲除几丁质酶和组织蛋白酶（ChiA/V
‑
Cath）有助于提高分泌蛋白的表达（J Virol Methods. 2004; 122:113
‑
118.）；在此基础上再敲除三个连续的非必需基因p26、p10、p74，可以使EGFP的产量增加2.6倍（Cell Biol Toxicol. 2010; 26:57
‑
68.）。
[0006]敲除非必需基因提高外源基因产量的机制是多样的。敲除组织蛋白酶（V
‑
Cath）基因可以降低蛋白质的降解；敲除p10可以释放感染晚期的细胞内转录资源。
[0007]此外，敲除非必需基因也可以减小杆状病毒基因组的大小，有利于容纳更大的外源DNA片段。野生型杆状病毒最多能插入大约40kb的外源DNA片段，如果用一个重组病毒表达多个蛋白，或用杆状病毒载体装载另一个病毒载体，40kb的空间经常捉襟见肘。如果能通过大段敲除基因，释放更多的空间，将极大扩展杆状病毒表达载体的应用范围。
[0008]专利技术人通过检索文献，发现杆状病毒基因组中存在大量非必需基因，并且一些非必需基因彼此相邻成簇存在，这些基因簇包括Ac68至Ac72的五个连续非必需基因。
[0009]Ac68敲除后不影响病毒的滴度，但不能杀死粉纹夜蛾的幼虫，所以这个基因被认为是一个口服感染因子（J Virol. 2012;86:3985
–
94.）。
[0010]Ac69编码的蛋白具有RNA帽子甲基转移酶的活性。敲除该基因不影响病毒在细胞
系中的复制（J Virol. 2003;77:3430
–
40.）。
[0011]Ac70编码了宿主特异性因子。敲除Ac70不影响病毒在Sf细胞中的复制，但在Tn细胞中病毒的增殖受损（J Virol. 1996;70:5123
–
30.）。
[0012]Ac71编码了凋亡抑制因子iap
‑
2。可能由于杆状病毒基因组中存在6个iap同源基因，所以敲除iap
‑
2并不影响病毒的复制（J Gen Virol. 1999;80:1055
–
1066.）。
[0013]Ac72基因功能未知。在BmNPV中敲除其同源基因Bm58a不影响病毒的复制（Virus Res. 2012;165:197
–
206.）。
[0014]总的说来，Ac68、Ac69、Ac70、Ac71和Ac72都是杆状病毒的非必需基因，至少在昆虫细胞系中复制时，这五个基因并不表现出重要的功能。同时敲除这些基因对外源基因表达量的影响以及病毒的增殖还未曾被关注过。
技术实现思路
[0015]本专利技术的目的在于提供一种基因敲除型杆状病毒载体，旨在解决
技术介绍
提及的表达量低及外源DNA片段容量低的问题。
[0016]本专利技术通过同时敲除Ac68、Ac69、Ac70、Ac71和Ac72，使病毒基因组减小约3kb，获得了一个外源蛋白产量提高的杆状病毒表达载体。
[0017]本专利技术通过同时敲除Ac68、Ac69、Ac70和Ac71，使病毒基因组减小约2.8kb，获得了一个外源蛋白产量提高的杆状病毒表达载体。
[0018]本专利技术是这样实现的，用带有Ac68
‑
72区段上下游同源臂的引物扩增rpsL
‑
AMP抗性筛选标记表达盒。
[0019]将获得的PCR产物电转化到含有Bacmid的大肠杆菌中，通过同源重组，氨苄青霉素抗性筛选，获得Ac68
‑
72片段被rpsL
‑
AMP替换的Bacmid，命名为Bacmid
‑
Ac68
‑
72::rpsL
‑
AMP。
[0020]为了释放筛选标记基因占据的病毒基因组空间，需要用反向筛选移除rpsL
‑
AMP抗性筛选标记表达盒。
[0021]用Ac68
‑
72区段上下游同源臂搭出一段反筛替换序列，将获得的反筛替换序列电转化到含有Bacmid
‑
Ac68
‑
72::rpsL
‑
AMP的大肠杆菌中，通过同源重组和链霉素抗性反向筛选，获得Ac68
‑
72片段敲除的Bacmid，命名为BacmidΔAc68
‑
72。此即为Ac68、Ac69、Ac70、Ac71和Ac72敲除的杆状病毒表达载体。
[0022]为了获得Ac68
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71敲除的Bacmid，需要将Ac72回补到原来的位点。用带有Ac68
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72区段上下游同源臂的引物扩增带有Ac72基因的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种杆状病毒表达载体，其特征在于，杆状病毒表达载体中Ac68、Ac69、Ac70和Ac71基因被同时敲除。2.一种杆状病毒表达载体，其特征在于，杆状病毒表达载体中Ac68、Ac69、Ac70、Ac71和Ac72基因被同时敲除。3.一种重组蛋白，其特征在于，用权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ五一IntClC一二N一五八六六，
申请(专利权)人：陕西杆粒生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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