本发明专利技术公开了一种基因敲除型杆状病毒表达载体。该载体通过同时敲除相邻的杆状病毒非必需基因Ac18、Ac19、Ac20、Ac21、Ac22和Ac23，使外源蛋白表达水平显著提高。同时，病毒的增殖特性未见显著变化。表达产量的提高能降低企业的生产成本，敲除大段基因能使载体容量增加。该杆状病毒表达载体可用于生物制品工业领域，特别是亚单位疫苗工业领域。
【技术实现步骤摘要】
一种Ac18-23敲除的杆状病毒表达载体
本专利技术属于重组蛋白质表达
，尤其涉及一种基因敲除的杆状病毒表达载体。
技术介绍
杆状病毒是特异感染节肢动物的双链DNA病毒，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographacalifornicanucleopolyhedrovirus,AcMNPV）是杆状病毒的模式种。自从1983年SmithGE等首次用杆状病毒在昆虫细胞中表达人β-干扰素基因以来（MolCellBiol.1983;3:2156-65.），由于具有低成本、高产量，而且具备各种翻译后修饰系统等优点，杆状病毒表达载体系统在科研和生产中被广泛应用。但相较于工业上普遍使用的原核表达系统（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌）和酵母表达系统，杆状病毒表达载体系统的产量还不尽人意。为此人们采取了多种策略提高该表达系统的产量，这些策略包括：1、改造启动子及周边元件。比如通过串联p6.9和p10启动子可以将GFP产量提高4.4倍（PLoSONE.2014;9(5):e96562.）；在polh启动子下游重复一次Burstsequence可以使GUS酶活提高1.5倍（BiotechnolBioeng.2010;107:909-16.）。2、构建抗凋亡载体或细胞系。用RNA干扰载体在昆虫细胞Sf9中表达Sf-caspase-1的dsRNA，可以成功沉默细胞中的Sf-caspase-1，使外源蛋白的产量显著提高（BiotechnolApplBiochem.2007;48:11-19.）。张潇月等将靶向Sf-caspase-1的双链小RNA编码序列直接克隆到杆状病毒基因组上，使表达的荧光素酶活性提高10倍（BMCBiotechnol.2018;18:24.）。3、敲除非必需基因。比如敲除几丁质酶和组织蛋白酶（ChiA/V-Cath）有助于提高分泌蛋白的表达（JVirolMethods.2004;122:113-118.）；在此基础上再敲除三个连续的非必需基因p26、p10、p74，可以使EGFP的产量增加2.6倍（CellBiolToxicol.2010;26:57-68.）。敲除非必需基因提高外源基因产量的机制是多样的。敲除组织蛋白酶（V-Cath）基因可以降低蛋白质的降解；敲除p10可以释放感染晚期的细胞内转录资源。此外，敲除非必需基因也可以减小杆状病毒基因组的大小，有利于容纳更大的外源DNA片段。野生型杆状病毒最多能插入大约40kb的外源DNA片段，如果用一个重组病毒表达多个蛋白，或用杆状病毒载体装载另一个病毒载体，40kb的空间经常捉襟见肘。如果能通过大段敲除基因，释放更多的空间，将极大扩展杆状病毒表达载体的应用范围。专利技术人通过检索文献，发现杆状病毒基因组中存在大量非必需基因，并且一些非必需基因彼此相邻成簇存在，这些基因簇包括Ac18至Ac23的六个连续非必需基因。Ac18编码一个含有353个氨基酸分子量大小为40.9kDa的蛋白质，存在于所有I型和II型NPV的病毒基因组中。缺失Ac18的病毒仍具有感染性，但与野生型病毒相比，Ac18突变的病毒需要更长的时间来感染并杀死幼虫（Virology.2007;367:71–81.）。Ac19编码一个含有108个氨基酸分子量大小为12.2kDa的蛋白质，存在于所有I型和大多数II型NPV病毒基因组中。当BmNPV中Ac19的同源基因Bm11缺失时并未影响病毒的复制，所以Ac19很可能是非必需基因（VirusRes.2012;165:197–206.JVirol.2012;86:2545–55.）。Ac20/21编码一个含有417个氨基酸分子量大小为47.7kDa的肌动蛋白重排诱导因子(ARIF1)。该基因为早期基因，将含有该基因的质粒转染到Tn-368细胞中能够诱导肌动蛋白的重排（JVirol.2001;75:3771–8.）。正常情况下，肌动蛋白重排诱导因子能够与F-肌动蛋白结合，缺失Ac20/21之后，质膜上肌动蛋白浓度显著减低。在该基因中心插入LacZ基因或将该基因的C-末端进行缺失，均不会导致病毒在Tn-368以及Sf细胞中的感染性丧失（JVirol.1997;71:7933–41.）。Ac20/21基因的必需与否目前还未知。Ac22编码一个含有382个氨基酸分子量大小为43.8kDa的口服感染因子（Pif-2）（JVirol.2002;76:5605–11.）。该基因敲除后，突变体病毒不能通过口服感染的方式感染昆虫，但对于培养的细胞仍然具有感染性（JVirol.2005;79:15258–64.）。Ac23编码一个含有690个氨基酸分子量大小为79.9kDa的融合蛋白（Fprotein），存在于II型鳞翅类NPV、GV和双翅目病毒的病毒基因组中。Ac23与BV的囊膜结构形成过程有关，敲除Ac23会导致病毒杀死幼虫的时间延长（JVirol.2003;77:328–39.）。总的说来，Ac18、Ac19、Ac20、Ac21、Ac22和Ac23都是杆状病毒的非必需（包括疑似非必需）基因或未知功能基因，至少在昆虫细胞系中复制时，这六个基因并不表现出重要的功能。同时敲除这些基因对外源基因表达量的影响以及病毒的增殖还未曾被关注过。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基因敲除型杆状病毒载体，旨在解决
技术介绍
提及的表达量低及外源DNA片段容量低的问题。本专利技术通过同时敲除Ac18、Ac19、Ac20、Ac21、Ac22和Ac23，使病毒基因组减小约6.1kb，获得了一个外源蛋白产量提高的杆状病毒表达载体。本专利技术是这样实现的，用带有Ac18-23区段上下游同源臂的引物扩增rpsL-AMP抗性筛选标记表达盒。将获得的PCR产物电转化到含有Bacmid的大肠杆菌中，通过同源重组，氨苄青霉素抗性筛选，获得Ac18-23片段被rpsL-AMP替换的Bacmid，命名为Bacmid-Ac18-23::rpsL-AMP。为了释放筛选标记基因占据的病毒基因组空间，需要用反向筛选移除rpsL-AMP抗性筛选标记表达盒。用Ac18-23区段上下游同源臂搭出一段反筛替换序列，将获得的反筛替换序列电转化到含有Bacmid-Ac18-23::rpsL-AMP的大肠杆菌中，通过同源重组和链霉素抗性反向筛选，获得Ac18-23片段敲除的Bacmid，命名为BacmidΔAc18-23。此即为Ac18、Ac19、Ac20、Ac21、Ac22和Ac23敲除的杆状病毒表达载体。为了检测基因敲除后的杆状病毒表达载体表达外源蛋白的能力和增殖能力，需要构建重组杆状病毒。以BacmidΔAc18-23和对照Bacmid为表达载体，与带有外源基因的质粒共转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒。经测定，敲除型重组杆状病毒的增殖曲线与野生型载体无显著区别。敲除型杆状病毒载体BacmidΔAc18-23的外源重组蛋白表达量显著高于对照载体。本专利技术同时敲除相邻的Ac18、Ac19、Ac20、Ac21、Ac22本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种杆状病毒表达载体，其特征在于，杆状病毒表达载体中Ac18、Ac19、Ac20、Ac21、Ac22和Ac23基因被同时敲除。/n
【技术特征摘要】
1.一种杆状病毒表达载体，其特征在于，杆状病毒表达载体中Ac18、Ac19、Ac20、Ac21、Ac22和Ac23基因被同时敲除。
2.一种重组蛋白，其特征在于，用权利要求1所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：陕西杆粒生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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