基于共表达分泌性荧光素酶快速滴定重组杆状病毒的方法技术

本发明专利技术涉及一种简便快速定量重组杆状病毒的方法，具体而言，该方法是通过检测共表达的荧光素酶活性来定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。本发明专利技术公开了一种分泌性荧光素酶表达盒：hr5增强子‑IE1启动子‑L21‑secrNluc‑IE1终止子，其核酸序列如SEQ ID NO：1所述。本发明专利技术还同时公开了一种基于共表达分泌性荧光素酶快速滴定重组杆状病毒的方法。采用本发明专利技术的方法数分钟内就能完成测定酶活。

【技术实现步骤摘要】
基于共表达分泌性荧光素酶快速滴定重组杆状病毒的方法
本专利技术涉及一种简便快速定量重组杆状病毒的方法，具体而言，该方法是通过检测共表达的荧光素酶活性来定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。
技术介绍
自上个世纪80年代建立以来，杆状病毒载体表达系统已经发展成基因工程领域常用的分子生物学工具，可以用来克隆目的基因高效表达重组蛋白制备蛋白药物或疫苗，或者用作DNA载体传递目的基因进行基因治疗。不管是重组表达还是基因治疗，构建的重组杆状病毒都必须评估病毒毒力，即病毒的感染能力，以便达到最佳的应用效果。病毒毒力或毒价可以定义为单位体积中活病毒颗粒的数量，即病毒滴度，通常通过观察病毒感染产生的细胞病变效应来评价。常规测定病毒滴度的方法就是基于这个原理，主要有蚀斑法(plaqueformationassay,PFA)和终点稀释法(endpointdilutionassay,EPDA)。细胞病变是一个缓慢的病理过程，观察到重组杆状病毒感染引起的典型细胞病变可能需要5-7天，因而这两种方法非常耗时。同时，这两种方法的检测结果也易受样品孵育条件和操作者技能本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分泌性荧光素酶表达盒，其特征是：/n所述荧光素酶表达盒为：/nhr5增强子-IE1启动子-L21-secrNluc-IE1终止子，其核酸序列如SEQ ID NO：1所述。/n

【技术特征摘要】
1.分泌性荧光素酶表达盒，其特征是：
所述荧光素酶表达盒为：
hr5增强子-IE1启动子-L21-secrNluc-IE1终止子，其核酸序列如SEQIDNO：1所述。


2.根据权利要求1所述的分泌性荧光素酶表达盒，其特征是：
hr5增强子-IE1启动子和IE1终止子序列均源于载体pIEx-1。


3.根据权利要求1所述的分泌性荧光素酶表达盒，其特征是：
L21序列为：5’-AACTCCTAAAAAACCGCCACC-3’。


4.根据权利要求1所述的分泌性荧光素酶表达盒，其特征是：
sercNluc为N端融合杆状病毒gp64基因信号序列的nano-Luciferase，其氨基酸如SEQIDNO:2所述，核酸序列如SEQIDNO:3所述。


5.基于共表达分泌性荧光素酶快速滴定重组杆状病毒的方法，其特征是包括以下步骤：
1.1)、制备sf9昆虫细胞悬液；
1.2)、制备重组杆状病毒标准样品：
利用如权利要求1所述的分泌性荧光素酶表达盒，构建获得分泌性荧光素酶共表达克隆载体pFastBacDual-hr5IE1-L21-secrNluc，
再利用pFastBacDual-hr5IE1-L21-secrNluc制备获得重组杆状病毒vAc-secrNluc，从而获得相应滴度的病毒标准样品；
1.3)、制备待测重组杆状病毒样品：
利用pFastBacDual-hr5IE1-L21-secrNluc，构建EGFP基因的克隆载体pFastBacDual-hr5IE1-L21-secrNluc-EGFP；
再利用pFastBacDual-hr5IE1-L21-secrNluc-EGFP制备获得待测病毒样品vAc-secrNluc-EGFP；
1.4)、病毒接种和酶活测定：
病毒标准样品接种于sf9的细胞悬液中，感染特定时间后进行酶活测定，得到该特定时间点的病毒标准样品的实际荧光素酶活性；
1.5)、以病毒标准样品病毒滴度的对数值作为横坐标，以其实际荧光素酶活性的对数值作为纵坐标，制作标准曲线和直线回归方程：
logE＝a×logN+b
N：病毒滴度(pfu/mL)
E：荧光素酶活性值(RLU)
a,b：分别为直线回归方程的斜率和截距；
1.6)、以待测病毒样品替代病毒标准样品，进行步骤1.4)，从而获得待测病毒样品的荧光素酶活性；...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈健，陈琴，徐萌，孟小力，李俊俊，李德友，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33