一种抗凋亡的杆状病毒表达载体制造技术

本申请涉及一种抗凋亡的杆状病毒表达载体，通过载体表达靶向Spodoptera frugiperda和Trichoplusia ni昆虫细胞caspase

【技术实现步骤摘要】
expression vector system.Biotechnol Bioeng.2009,104(2):390
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9.)。虽然High Five细胞的表达量高于Sf细胞系，但它不适合用于杆状病毒的转染。工业生产上通常都是两种细胞交叉使用，但遗憾的是，目前还没有能同时在Sf细胞和Tn细胞中抗凋亡的杆状病毒表达载体。如果杆状病毒表达载体能同时在Sf和Tn细胞系中表现出抗凋亡特性，这将极大地推进抗凋亡杆状病毒表达载体在工业上的应用。

技术实现思路

[0007]本申请的目的在于提供一种广谱抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体，旨在解决
技术介绍
提及的问题。
[0008]本申请通过Sf
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caspase
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1和Tn
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caspase
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1编码序列对比，获得唯一一段大于21nt的共有序列SEQ ID NO:1。根据此序列，本申请设计了两段RNAi的靶位点：
[0009]gccgcactgagacagatggct(互补序列为SEQ ID NO:2)
[0010]gcactgagacagatggctcac(互补序列为SEQ ID NO:3)
[0011]本申请是这样实现的，将靶向上述序列的小RNA表达盒克隆到杆状病毒载体基因组中。
[0012]进一步，该表达盒序列包括人U6启动子序列、21nt引导链互补序列、9nt loop序列、21nt引导链编码序列、作为转录终止信号的TTTTT序列；
[0013]所述21nt引导链互补序列分别为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5；
[0014]所述21nt引导链编码序列分别为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
[0015]进一步，根据RNA中存在G
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U配对现象，在与引导链互补序列中引进若干C到T的点突变，在不影响siRNA加工的前提下，降低DNA链形成发夹结构的倾向。
[0016]本申请另一目的在于用上述的抗凋亡重组杆状病毒载体制备蛋白制品。
[0017]本申请另一目的在于用上述的抗凋亡重组杆状病毒载体制备疫苗。
[0018]本申请把干扰两种工业上常用昆虫细胞Sf
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caspase
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1和Tn
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caspase
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1的siRNA序列和调控序列克隆到杆状病毒基因组上，构建了能延长感染细胞存活期的杆状病毒表达载体。该载体可用于构建表达外源基因的重组杆状病毒。因为病毒载体上携带抑制昆虫细胞凋亡的siRNA序列，所获得的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，蛋白表达水平显著提高。经测试，以荧光素酶作为报告基因，本申请的抗凋亡载体荧光素酶活性以及蛋白量在Sf9细胞和High Five细胞中提高大约1倍(见附图3、图4)，说明本申请确实能在两种细胞系中发挥预期作用。本申请获得的杆状病毒载体可用于蛋白药物和疫苗的工业化生产。
附图说明
[0019]图1本申请提供的重组杆状病毒载体的抗凋亡机制示意图。
[0020]图2使用本申请的不同实施例表达GFP荧光强度对比。Ctrl为不编码siRNA的对照；563
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4T,563
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5T,566,566
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4T为4种抗凋亡载体的实施例；外源基因GFP由p10启动子转录。
[0021]图3使用本申请提供的重组杆状病毒载体制备的表达荧光素酶的SDS
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PAGE检测结果。
[0022]图4使用本申请提供的重组杆状病毒载体制备的表达荧光素酶的酶活检测结果。
具体实施方式
[0023]为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
[0024]下面结合附图对本专利技术的应用原理作详细的描述。
[0025]本申请根据Sf
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caspase
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1和Tn
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caspase
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1共有序列SEQ ID NO:1设计了两段RNAi的靶位点：
[0026]gccgcactgagacagatggct(563
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583)
[0027]gcactgagacagatggctcac(566
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586)
[0028]根据这两个靶位点设计四个siRNA编码序列(DNA序列分别为：SEQ ID NO:4+loop+SEQ ID NO:2+TTTTT和SEQ ID NO:5+loop+SEQ ID NO:3+TTTTT)：
[0029]563
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4T:gctgtattgagatagatggctgcttattaaagccatctgtctcagtgcggcttttt
[0030]563
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5T:gctgtattgagatagatggttgcttattaaagccatctgtctcagtgcggcttttt
[0031]566:gcactgagacagatggctcacgcttattaagtgagccatctgtctcagtgcttttt
[0032]566
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4T:gcattgagatagatggtttacgcttattaagtgagccatctgtctcagtgcttttt
[0033]进一步，通过重叠PCR，将上述序列分别连接在人U6启动子下游，使转录从上述序列的第一个碱基“G”开始；
[0034]进一步，将带有U6启动子的siRNA序列敲入到杆状病毒表达载体上(如图1所示，敲入方法参见Zhang X,Xu K,Ou Y,Xu X,Chen H.Development of a baculovirus vector carrying a small hairpin RNA for suppression of sf
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caspase
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1 expression and improvement of recombinant protein production.BMC Biotechnol.2018,18(1):24.)，获得抗凋亡杆状病毒表达载体。
[0035]下面结合实施例对本申请的应用效果进一步说明。
[0036](1)表达GFP评估上述四种抗凋亡杆状病毒表达载体
[0037]通过同源重组，获得5株表达GFP的重组杆状病毒，其中一株没有siRNA序列的作为对照(Ctrl)。如附图2所示，在感染Sf9细胞4天后，用流式细仪检测细胞中绿色荧光的强度。除了566
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4T外，其余三个重组病毒感染的细胞中，绿色荧光的强度显著高于对照。说明本申请的shRNA确实能提高外源基因的表达量。其中563
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5T作为候选抗凋亡载体，进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种shRNA，其特征在于，所述shRNA为563
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4T，其中，563
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4T的引导链互补序列为gctgtattgagatagatggct，563
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4T的引导链编码序列为agccatctgtctcagtgcggc。2.如权利要求1所述的shRNA，其特征在于，所述563
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4T的核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，
申请(专利权)人：陕西杆粒生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：