金银花LjC3H1基因组织特异性启动子及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种金银花LjC3H1基因组织特异性启动子，涉及生物技术领域，所述特异性启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术还提供了包含LjC3H1基因组织特异性启动子的表达盒、重组载体以及宿主细胞。具有驱动或调控LjC3H1基因表达进一步高产绿原酸的作用。调控LjC3H1基因表达进一步高产绿原酸的作用。调控LjC3H1基因表达进一步高产绿原酸的作用。

【技术实现步骤摘要】
金银花LjC3H1基因组织特异性启动子及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，更具体的说是涉及金银花LjC3H1基因组织特异性启动子及其应用。

技术介绍

[0002]金银花(Lonicerajaponica Thunb.)又名忍冬，为忍冬科忍冬属植物，是亚洲国家广泛使用的一种药用植物。金银花具有抑菌、抗病毒、解热、止血、抗氧化、降血脂、免疫调节等作用，常用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热血毒痢、风热感冒、瘟病发热等症。目前已从金银花中发现200多种化合物，绿原酸(chlorogenic acids)是金银花的主要药效成分，其具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等活性。2020版药典规定，金银花为忍冬(L.japonica)的干燥花蕾或带初开的花，绿原酸含量不得少于1.5％。金银花不仅由于品种差异导致绿原酸含量差异较大，而且由于受环境因子影响，同一品种在同一时期不同地域、或是同一地域不同年份其绿原酸含量变化较大，正品金银花常常容易被误判为伪品。因此，有效提高和稳定绿原酸含量是金银花育种和栽培中面临的重大难题。
[0003]绿原酸是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物，苯丙氨酸解氨酶(PAL)，肉桂酸
‑4‑
羟化酶(C4H)与4
‑
羟基桂皮酰辅酶A连接酶(4CL)是最初三步反应的关键酶。在这三种酶的作用下，苯丙氨酸转化为肉桂酸，后者再转化生成香豆酰辅酶A，此后主要途径有两条：第一条是香豆酰奎宁酸途径，香豆酰奎宁酸在香豆酸羟基化酶(C3H)的作用下生成绿原酸；第二条途径是香豆酰莽草酸途径，香豆酰莽草酸在C3H作用下生成咖啡酸莽草酸，继而在羟基化肉桂酰辅酶A/奎宁酸羟化肉桂酰基转移酶(LJC3H1)作用下酯化生成绿原酸，可看出C3H在两条途径中都起着重要的作用。
[0004]启动子是调控基因转录与表达的主要组件，其与RNA聚合酶准确结合后决定基因表达起始。启动子包含与转录因子相结合作用元件，与转录因子共同调控基因的表达，在植物适应环境和生长发育中起重要的调控作用。植物中的启动子据其对基因的调控方式与表达部位特点，可以分为组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子三种不同类型。不同物种、不同类型的启动子差异性极为明显。随着基因组分析技术的不断完善，人类通过基因工程调控手段提高农作物产量、有效成分含量及提高对逆境的抵抗力已成为了可能。在金银花育种中，虽然在转基因技术方面不断取得了重大突破，但由于发掘的优异基因启动子极少，严重限制了有效成分合成相关基因表达调控的研究与应用。
[0005]因此，发掘金银花启动子，并对其功能进行研究，在金银花有效成分合成相关基因表达调控方面具有重要的经济价值和应用价值。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了一种金银花LjC3H1基因上游的启动子，并对其进行功能分析，可为提高金银花绿原酸含量的育种实践提供重要的启动子序列资源。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种金银花LjC3H1基因组织特异性启动子，所述特异性启动子的核苷酸序列为：
[0009](1)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
[0010](2)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的互补序列；
[0011](3)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸且具有相同功能的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
[0012]本专利技术还提供一种表达盒，含有上述金银花LjC3H1基因组织特异性启动子。
[0013]本专利技术还提供一种重组载体，含有上述金银花LjC3H1基因组织特异性启动子。
[0014]本专利技术还提供一种含有上述组织特异性启动子或上述表达盒或上述重组载体的宿主细胞，所述宿主细胞选自细菌、藻类和真菌宿主细胞。
[0015]本专利技术还提供一种在金银花中驱动或调控LjC3H1基因表达的方法，包括将LjC3H1基因有效连接至上述的组织特异性启动子，或将上述表达盒或上述重组载体导入金银花植株中。
[0016]本专利技术还提供一种驱动或调控金银花绿原酸代谢的方法，包括将LjC3H1基因有效连接至上述的组织特异性启动子，或将上述表达盒或上述重组载体导入金银花植株中。
[0017]本专利技术还提供一种高产绿原酸的转基因金银花生产方法，包括将LjC3H1基因有效连接至上述的组织特异性启动子，或将上述表达盒或上述重组载体导入金银花植株中。
[0018]本专利技术还提供上述金银花LjC3H1基因组织特异性启动子在金银花育种中的应用。
附图说明
[0019]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0020]图1为构建的pLjC3H1::GUS表达载体图谱；
[0021]图2为转基因拟南芥抗Basta筛选；
[0022]图3为转基因拟南芥GUS检测；
[0023]图4为转基因水稻GUS检测；
[0024]图5为转基因拟南芥不同组织蛋白浓度；
[0025]图6为转基因拟南芥不同组织GUS活性定量测定。
具体实施方式
[0026]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0027]本专利技术实施例公开了一种金银花LjC3H1基因组织特异性启动子及其应用，所涉及的试剂或方法，如无特殊提及均为常规试剂或方法，对其不做具体限定。
[0028]实施例1
[0029]1.金银花LjC3H1基因启动子的获得
[0030]染色体步移技术克隆得到金银花LjC3H1基因启动子序列：
[0031](1)构建连有接头序列的GenomeWalker文库
[0032]采用CTAB法提取金银花基因组DNA，并进行纯化，DNA分别采用带有接头的GenomeWalkerAdaptorBamHI、EcoRI、NdeI和XhoI四种限制性内切酶酶切。
[0033](2)PCR扩增
[0034]采用巢式PCR的方法进行扩增，第一次PCR使用外侧接头引物(AP1:5'
‑
AAATGTAGACCGTGCTGT
‑
3'，SEQ ID NO.2)以及金银花外侧基因特异引物(GSP1：5'
‑
ACCGCCTCCATCAAGCTGCACAC CG
‑
3'，SEQ ID NO.3)，PCR产物经过稀释，并作为第二次PCR的模板。第二次P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种金银花LjC3H1基因组织特异性启动子，其特征在于，所述特异性启动子的核苷酸序列为：(1)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；(2)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的互补序列；(3)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸且具有相同功能的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。2.一种表达盒，其特征在于，含有权利要求1所述金银花LjC3H1基因组织特异性启动子。3.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求1所述金银花LjC3H1基因组织特异性启动子。4.一种含有权利要求1所述组织特异性启动子或权利要求2所述表达盒或权利要求3所述重组载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自细菌、藻类和真菌宿主细胞。...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋向辉，刘卫今，杨莉君，
申请(专利权)人：怀化学院，
类型：发明
国别省市：