一种扩张性/肥厚型心肌病基因突变猪成纤维细胞系的构建方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术及生物技术领域，涉及一种扩张性/肥厚型心肌病基因突变猪成纤维细胞系的构建方法。本发明专利技术先设计一种敲除CSRP3基因的sgRNA，将所述sgRNA构建至载体px459后，将表达载体px459

【技术实现步骤摘要】
一种扩张性/肥厚型心肌病基因突变猪成纤维细胞系的构建方法


[0001]本专利技术属于基因工程技术及生物
，涉及一种扩张性/肥厚型心肌病基因突变猪成纤维细胞系的构建方法，具体涉及靶向敲除CSRP3基因的sgRNA及敲除CSRP3基因的猪胚胎成纤维细胞的生产方法。

技术介绍

[0002]扩张性心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)是一种常见的心肌疾病，其特征是左心室或双心室扩张和收缩功能障碍，每250人中就会有1人患病。DCM的病因可分为遗传性和非遗传性两种，由编码细胞骨架、肌节或核包膜蛋白的的突变基因引起的遗传性DCM约占所有DCM病例的35％。
[0003]肥厚型心肌病(Hypertrophic Cardiomyopathy，HCM)是一种常见的心血管疾病，其特征是心室壁增厚。HCM可能导致左心室(LV)流出道梗阻、心肌缺血或二尖瓣异常。HCM患者可能出现呼吸困难、胸痛、心悸、晕厥甚至心源性猝死(SCD)。
[0004]CSRP3是半胱氨酸和富含甘氨酸的蛋白质3基因(Cysteine and Glycine
‑
Rich Protein 3Gene)，编码肌肉LIM蛋白(muscle LIM protein，MLP)，其在心肌生理学和病理学中具有多重作用，包括细胞命运决定、转录调节、细胞粘附和运动、信号转导和细胞骨架组织等。MLP可以与细胞核中的核转录因子MyoD、肌生成素和肌源调节因子4(MRF4)结合。CSRP3突变可导致扩张性心肌病和肥厚型心肌病。MLP缺陷小鼠表现出严重的心功能障碍，例如心脏压力和容量的改变，从而导致扩张性心肌病的发展并伴有肥大和进行性心力衰竭。
[0005]最近的一项研究表明，HCM病例中CSRP3突变的比例高于对照人群，这为CSRP3突变确实与HCM相关提供了理论基础。在这里，我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在猪成纤维细胞中高效实现CSRP3基因突变，为CSRP3基因突变猪模型的构建、DCM/HCM的研究及药物筛选提供了基础。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种扩张性/肥厚型心肌病基因突变猪成纤维细胞系的构建方法，构建的细胞系可用于胚胎移植以构建CSRP3基因突变猪，为DCM/HCM的研究及药物筛选提供基础。
[0007]在第一个方面，本专利技术提供了靶向敲除CSRP3基因的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2。
[0008]本专利技术进一步提供编码所述sgRNA的DNA分子。
[0009]本专利技术进一步提供含有所述DNA的载体。
[0010]例如，可以将所述sgRNA通过酶切连接至载体px459上，具体方法为：
[0011]在CSRP3基因第三个外显子的靶点序列GATTTCTTCTGCGTGGTAGA/
GTGGTAGACGGTCTTGTCGC的5
’
端加上BbsI的酶切位点caccg，构成序列caccgGATTTCTTCTGCGTGGTAGA/caccGTGGTAGACGGTCTTGTCGC，并人工合成其互补序列aaacTCTACCACGCAGAAGAAATCc/aaacGCGACAAGACCGTCTACCACc，将互补序列caccgGATTTCTTCTGCGTGGTAGA&aaacTCTACCACGCAGAAGAAATCc/
[0012]caccGTGGTAGACGGTCTTGTCGC&aaacGCGACAAGACCGTCTACCACc退火所形成的双链DNA分子，与经BbsI酶切的px459载体连接，从而构建表达载体px459
‑
CSRP3。
[0013]在第二个方面，本专利技术提供了一种敲除了CSRP3基因的细胞的构建方法，包括：
[0014]利用CRISPR
‑
Cas9系统敲除所述细胞的CSRP3基因，所述CRISPR
‑
Cas9系统使用的sgRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2。
[0015]进一步地，所述利用CRISPR
‑
Cas9系统敲除所述细胞的CSRP3基因中使用px459载体。
[0016]进一步地，所述细胞为猪胚胎成纤维细胞。
[0017]在第三个方面，本专利技术提供了根据如上所述的构建方法构建得到的细胞及其在构建CSRP3基因突变动物模型或DCM/HCM药物筛选中的应用。
[0018]进一步地，所述动物模型为猪模型。
[0019]本专利技术的有益效果在于：
[0020]本专利技术首次得到CSRP3基因敲除猪胚胎成纤维细胞，利用CRISPR
‑
Cas9系统从猪胚胎成纤维细胞中敲除CSRP3基因，有效改进了抑制剂、敲低、干扰等特异性不强、基因沉默不彻底等缺点。在疾病模型方面，目前还没有针对CSRP3基因敲除的DCM/HCM模型细胞，本申请创新性地构建了在基因组序列水平部分模拟此类疾病的细胞，在后续中，我们可以将此细胞通过胚胎移植技术产生带有CSRP3基因敲除的DCM/HCM模型猪，为DCM/HCM药物筛选和临床治疗提供基础。
附图说明
[0021]图1为px459
‑
CSRP3质粒构建测序结果；
[0022]图2为CSRP3基因敲除猪成纤维细胞系鉴定引物设计；
[0023]图3为CSRP3基因敲除猪成纤维细胞系鉴定引物测试图；
[0024]图4为CSRP3基因敲除猪成纤维细胞系PCR条带图；
[0025]图5为CSRP3基因敲除猪成纤维细胞系测序结果图。
具体实施方式
[0026]下面结合附图和实施例，对本专利技术进行具体描述。显然，所描述的实施例仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例中未详加展开说明的实验步骤，可视为按照一般的分子生物学方法进行。
[0027]实施例中所用的px459质粒购买于武汉淼灵生物科技有限公司，实施例中所使用的猪胚胎成纤维细胞由中国农业大学杜旭光老师赠予，具体提取方法见实施例1。
[0028]实施例1猪胚胎成纤维细胞的提取
[0029]1.从子宫剥离胎儿，放于直径10cm的玻璃培养皿中，用含3X双抗的PBS冲洗数次，
直至无血色。用无菌剪刀将头、四肢、尾及内脏去除(剪掉的组织用作性别鉴定)，再用PBS冲洗数次，直至无血色。
[0030]2.将胎儿组织转入另一干净的10cm细胞培养皿中，用剪刀将其剪碎成1mm3的小块，加入15
‑
20ml消化液。
[0031]3.把培养皿放入5％CO2，39.5℃的培养箱中，根据解离效果消化4至8h。
[0032]4.将消化液和组织一起转入50ml尖本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.靶向敲除CSRP3基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2。2.编码权利要求1所述sgRNA的DNA分子。3.含有权利要求2所述DNA的载体。4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体为px459。5.一种敲除了CSRP3基因的细胞的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：利用CRISPR
‑
Cas9系统敲除所述细胞的CSRP3基因，所述CRISPR
‑
Cas9系统使用的sgRNA的核苷酸序列为SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：庄乐南，巩倩，刘艳，金佳敏，贺津，王华南，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：