用于治疗C9ORF72相关疾病的三功能腺伴随病毒(AAV)载体制造技术

本公开内容提供了用于治疗包括ALS和FTD在内的C9ORF72相关疾病的分离的启动子、转基因表达盒、载体、试剂盒和方法。试剂盒和方法。试剂盒和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗C9ORF72相关疾病的三功能腺伴随病毒(AAV)载体
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请根据35U.S.C.
§
119(e)要求于2019年10月22日提交的美国临时申请号62/924,351的利益，所述美国临时申请的内容通过引用以其整体并入本文。


[0003]本专利技术涉及基因治疗领域，包括用于在受试者或细胞中表达分离的多核苷酸的AAV载体。本公开内容还涉及核酸构建体、启动子、载体和包括多核苷酸的宿主细胞，以及将外源DNA序列递送至靶细胞、组织、器官或生物的方法，以及用于治疗或预防c9orf72相关疾病或病症，例如肌萎缩侧索硬化(ALS)和额颞叶变性(FTLD)的方法。

技术介绍

[0004]基因治疗旨在改善患者的临床后果，所述患者患有由基因表达谱中的异常引起的遗传突变或获得性疾病。基因治疗包括治疗或预防起因于缺陷基因或者异常调控或表达例如表达不足或过表达(其可以导致病症、疾病、恶性肿瘤等)的医学状况。例如，由缺陷基因引起的疾病或病症可以通过向患者递送校正性遗传材料进行治疗、预防或改善，或者可以通过例如用校正性遗传材料，使患者的缺陷基因改变或沉默进行治疗、预防或改善，导致遗传材料在患者内的治疗性表达。
[0005]基因疗法的基础是供应具有活性基因产物(有时称为转基因或治疗性核酸)的转录盒，例如，其可以导致正面的功能获得效应、负面的功能丧失效应或另一种后果。此类后果可以归于治疗性蛋白质例如抗体、功能性酶或融合蛋白的表达。基因疗法也可以用于治疗由其它因素引起的疾病或恶性肿瘤。人单基因病症可以通过正常基因对靶细胞的递送和表达进行治疗。校正基因在患者的靶细胞中的递送和表达可以经由众多方法来进行，所述方法包括使用改造的病毒和病毒基因递送载体。
[0006]腺伴随病毒(AAV)属于细小病毒科(Parvoviridae)，且更具体而言构成依赖性细小病毒属。衍生自AAV的载体(即重组AAV(rAVV)或AAV载体)对于递送遗传材料是有吸引力的，因为(i)它们能够感染(转导)广泛多种非分裂和分裂细胞类型，包括肌细胞和神经元；(ii)它们缺乏病毒结构基因，从而减少对病毒感染的宿主细胞应答，例如干扰素介导的应答；(iii)野生型病毒在人中被视为非病理性的；(iv)与能够整合到宿主细胞基因组内的野生型AAV形成对比，复制缺陷型AAV载体缺乏rep基因并且一般作为附加体持续存在，因此限制了插入诱变或基因毒性的风险；并且(v)与其它载体系统相比，AAV载体一般被视为相对较弱的免疫原，并且因此并不触发显著的免疫应答(参见ii)，因此获得载体DNA的持久性和治疗性转基因的潜在地长期表达。
[0007]肌萎缩侧索硬化(ALS)和额颞叶变性(FTLD)是没有有效治疗的严重的神经退行性疾病。ALS是致命的神经退行性疾病，其临床特征在于通常在症状发作的两到三年内的进行性麻痹，导致因呼吸衰竭的死亡(Rowland和Schneider，N.Engl.J.Med.，2001，344，1688
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1700)。ALS是西方世界第三大常见的神经退行性疾病(Hirtz等人，Neurology，2007，68，
326
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337)，并且目前不存在有效疗法。大约10％的病例在性质上是家族性的，而诊断有该疾病的大部分患者被归类为散发性，因为它们似乎在整个人群中随机发生(Chio等人，Neurology，2008，70，533
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537)。一些患者还可能发展为额颞叶痴呆。额颞叶痴呆(FTD)是起因于脑的颞叶和额叶的进行性退化的一组有关状况。取决于受影响的区域，FTD患者患有痴呆、行为异常、语言障碍和人格改变。
[0008]对于常染色体显性FTD和ALS已报道来自多个家族的强遗传联系和证据。基于临床、遗传和流行病学数据，越来越多地认识到ALS和FTD代表重叠的疾病连续体，其病理特征在于遍及中枢神经系统的TDP
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43阳性包涵体的存在(Lillo和Hodges，J.Clin.Neurosci.，2009，16，1131
‑
1135；Neumann等人，Science，2006，314，130
‑
133)。C9orf72基因的非编码区中的突变已鉴定为ALS和FTD两者的最常见的遗传原因(DeJesus
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Hernandez等人，Neuron.2011Oct 20；72(2):245
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56；Renton等人，Neuron.2011年10月20日；72(2):257
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68)。表达了c9orf72的两种主要的成熟mRNA转录物同种型，v1和v2，具有提议的不同细胞内功能。v1调控响应细胞应激的应激颗粒组装，而v2似乎并不参与应激颗粒组装或调控。取决于c9orf72转录物的同种型，突变携带者具有在第一个内含子或启动子区域中的GGGGCC六核苷酸重复扩增(Beck等人，Am J Hum Genet.2013年3月7日；92(3):345
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53)。患者通常具有数百或数千个重复，而健康对照显示<33个重复(Beck等人，2013；van der Zee等人，Hum Mutat.2013年2月；34(2):363
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73)。
[0009]除FTD和ALS中常见的TDP
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43聚集体之外，C9orf72突变携带者还具有特别是在小脑、海马和额叶新皮质中的丰富的星形、TDP
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43阴性神经元细胞质包涵体(NCI)，其对于蛋白酶体系统(UPS)的标记物例如p62或泛素染色呈阳性(Al Sarraj等人，Acta Neuropathol.2011年12月；122(6):691
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702)。这些TDP
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43阴性包涵体含有二肽重复蛋白(DPR)，其由所有读码框中的C9orf72重复的有义和反义转录物两者ATG非依赖性地翻译(Ash等人，Neuron.2013年2月20日；77(4):639
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46；Gendron等人，Acta Neuropathol.2013年12月；126(6):829
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44；Mann等人，Acta Neuropathol Commun.2013年10月14日；1():68)。
[0010]尽管近年来关于诊断标准、临床评价仪器、神经心理学测试、脑脊液生物标记物和脑成像技术方面已取得了进展，但迄今为止，不存在用于ALS或FTD的治愈性治疗。本公开内容解决了关于神经退行性疾病如ALS和FTD的有效治疗的需要。

技术实现思路

[0011]本公开内容部分描述了三功能AAV载体及其在治疗c9orf72相关疾病，特别是c9orf72六核苷酸重复扩增相关疾病中的用途。本文所述的AAV载体的三重功能包含c9orf72基因补充、c9orf72有义转录物的敲减和c9orf72反义转录物的敲减。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种编码C9ORF72蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列是密码子优化的。2.权利要求1的核酸序列，其中密码子优化的序列选自表2中阐述的序列。3. 权利要求1的核酸序列，其包含与选自SEQ ID NO 14
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52中的任何一个的核酸序列具有至少85%同一性的核酸序列。4. 一种转基因表达盒，其包含启动子；和权利要求1
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3中任一项的核酸序列。5.一种转基因表达盒，其包含启动子；权利要求1
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3中任一项的核酸序列；c9orf72有义转录物特异性抑制剂；和c9orf72反义转录物特异性抑制剂。6.权利要求5的转基因表达盒，其中所述c9orf72有义转录物特异性抑制剂是核酸、适体、抗体、肽或小分子中的任一种。7.权利要求6的转基因表达盒，其中所述核酸是单链核酸或双链核酸。8. 权利要求6的转基因表达盒，其中所述核酸是微小RNA (miRNA)。9.权利要求5的转基因表达盒，其中所述有义转录物抑制剂选自表4中阐述的miRNA。10.权利要求5的转基因表达盒，其中所述反义转录物抑制剂选自表3中阐述的miRNA。11.权利要求4或5的转基因表达盒，其进一步包含两个反向末端重复(ITR)。12.权利要求4或5的转基因表达盒，其进一步包含最小调控元件。13.权利要求4或5的转基因表达盒，其中所述启动子对于神经元中的表达是特异性的。14. 权利要求13的转基因表达盒，其中所述启动子是人突触素1 (hSyn)启动子。15.权利要求4或5的转基因表达盒，其中所述核酸是人核酸。16.一种核酸载体，其包含权利要求4或5的表达盒。17.权利要求16的载体，其中所述载体是腺伴随病毒(AAV)载体。18.权利要求17的载体，其中所述AAV载体的衣壳序列的血清型和ITR的血清型独立地选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。19.权利要求27的载体，其中所述衣壳序列是突变型衣壳序列。20.一种哺乳动物细胞，其包含权利要求16
‑
19中任一项的载体的。21.一种制备重组腺伴随病毒(rAAV)载体的方法，其包括将以下插入腺伴随病毒载体内：启动子；和权利要求1
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3中任一项的至少一种核酸。22.一种制备重组腺伴随病毒(rAAV)载体的方法，其包括将以下插入腺伴随病毒载体内：启动子；权利要求1
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3中任一项的至少一种核酸；c9orf72有义转录物特异性抑制剂；和c9orf72反义转录物特异性抑制剂。
23.权利要求21或22的方法，其中所述核酸是人核酸。24.权利要求21或22的方法，其中所述AAV载体的衣壳序列的血清型和ITR的血清型独立地选自AAV1、AAV2、A...

【专利技术属性】
技术研发人员：P，
申请(专利权)人：应用遗传科技公司，
类型：发明
国别省市：