用于治疗遗传性听力损失的腺相关病毒(AAV)系统技术方案

本文描述了在用于治疗遗传性听力损失的基于重组腺相关病毒(rAAV)的基因疗法中使用的优化修饰的GJB2cDNA和相关遗传元件。的优化修饰的GJB2cDNA和相关遗传元件。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗遗传性听力损失的腺相关病毒(AAV)系统
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请根据35 U.S.C.
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119(e)要求2019年9月30日提交的美国临时申请第62/907,834号的权益，该申请的内容通过引用以其整体并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请包括序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子提交并且在此通过引用以其整体并入。于2020年9月28日生成的所述ASCII副本被命名为119561
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01920_SL并且大小为31,079字节。
专利

[0005]本专利技术涉及基因疗法领域，包括用于在受试者或细胞中表达分离的多核苷酸的AAV载体。本公开内容还涉及包含该多核苷酸的核酸构建体、启动子、载体和宿主细胞，以及将外源DNA序列递送到靶细胞、组织、器官或生物体的方法，和用于治疗或预防遗传性听力损失的方法。
[0006]专利技术背景
[0007]基因疗法旨在改善遭受遗传突变或遭受基因表达谱中的畸变引起的获得性疾病的患者的临床结果。基因疗法包括治疗或预防由缺陷基因或者异常调控或表达(例如，表达不足或过表达)引起的医学状况，其可以导致紊乱、疾病、恶性肿瘤等。例如，由缺陷基因引起的疾病或紊乱可以通过向患者递送矫正性遗传物质来治疗、预防或改善，或者可以通过改变或沉默缺陷基因来治疗、预防或改善，例如，将矫正性遗传物质用于患者导致该遗传物质在该患者体内的治疗性表达。
[0008]基因疗法的基础是提供具有活性基因产物的转录盒(有时称为转基因或治疗性核酸)，例如，该活性基因产物可以导致积极功能增益效应、负面功能损失效应或其他结果。这样的结果可归因于治疗性蛋白(诸如抗体、功能性酶或融合蛋白)的表达。基因疗法也可用于治疗由其他因素引起的疾病或恶性肿瘤。人类单基因紊乱可以通过向靶细胞递送和表达正常基因来治疗。矫正性基因在患者的靶细胞中的递送和表达可以经由多种方法进行，包括使用工程化病毒和病毒基因递送载体。
[0009]腺相关病毒(AAV)属于细小病毒科(Parvoviridae)，并且更具体地属于依赖性细小病毒属(Dependoparvovirus)。源自AAV的载体(即，重组AAV(rAVV)或AAV载体)在递送遗传物质方面具有吸引力，原因是(i)它们能够感染(转导)许多种非分裂和分裂细胞类型，包括肌细胞和神经元；(ii)它们缺少病毒结构基因，从而减弱宿主细胞对病毒感染的反应，例如，干扰素介导的反应；(iii)野生型病毒被认为在人类中是非致病性的；(iv)与能够整合到宿主细胞基因组中的野生型AAV相比，复制缺陷型AAV载体缺少rep基因并且通常以附加体(episome)的形式保持，从而限制插入性诱变或遗传毒性的风险；和(v)与其他载体系统相比，AAV载体通常被认为是免疫原性相对较低并且因此不会触发严重的免疫应答(见ii)，从而获得载体DNA的持久性和潜在的治疗性转基因的长期表达。
[0010]非综合征性听力损失和耳聋(DFNB1；也称为间隙连接蛋白26耳聋)是常染色体隐
性的并且以先天性非进行性的轻度至严重的感觉神经性听力损伤为特征。GJB2基因编码间隙连接蛋白
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26，它在耳蜗支持细胞中表达，形成控制钾稳态的间隙连接，这对于毛细胞的存活和功能以及正常听力是关键的。GJB2中的突变损害间隙连接和耳蜗稳态，导致毛细胞功能障碍和听力损失。
[0011]听力损失是最常见的遗传性感觉紊乱。在发达国家诸如美国，遗传突变是大多数幼儿听力损失的原因，据估计，在言语发育之前每500名儿童中就有1名受其影响(Shearer等人,“Hereditary Hearing Loss and Deafness Overview”,2017)。由于先天性听力损失是儿童中最普遍的慢性状况之一，因此常规进行新生儿筛查。在已检测到缺陷的那些病例中，通常随后进行遗传测试。
[0012]遗传测试可以用于通过鉴定GJB2中的双等位基因致病性变异来诊断DFNB1，该双等位基因致病性变异包括序列变异和改变间隙连接β
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2蛋白(间隙连接蛋白26)表达的上游顺式调控元件中的变异。当在受影响的家庭成员中检测到引起DFNB1的GJB2致病性变异时，可以对有风险的亲属进行携带者测试、对风险增加的妊娠进行产前测试、以及进行植入前遗传诊断。Smith&Jones.Nonsyndromic Hearing Loss and Deafness,DFNB1.1998.在Adam等人编著GeneReviews.University of Washington,Seattle；Kemperman等人Journal of the Royal Society of Medicine 2002 95:171
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177中。由于耳蜗是外科手术可及的并且局部应用于相对免疫保护的环境是可能的，因此使用病毒载体的基因疗法是用于治疗听力损失的有吸引力的方法。
[0013]然而，仍然需要有效的疗法来治疗感觉神经性听力损失。
[0014]专利技术概述
[0015]本文描述的技术涉及通过重组腺相关病毒(rAAV)载体表达间隙连接蛋白β2(GJB2)来治疗或预防听力损失的方法和组合物，其中该rAAV载体包含已经经过密码子优化的GJB2核酸序列。在一些实施方案中，rAAV载体包含已经经过密码子优化的GJB2核酸序列并组合了经测试GJB2表达最佳的启动子。因此，本公开内容涉及rAAV载体，通过该rAAV载体GJB2可以被包装用于靶向递送至罹患遗传性听力损失的患者，包括带有GJB2基因隐性或显性常染色体突变的患者。GJB2中的突变损害间隙连接和耳蜗的稳态，导致毛细胞功能障碍和听力损失。如本文描述的GJB2基因疗法的目标是恢复功能性间隙连接和保存毛细胞以改善听力。
[0016]根据一方面，本公开内容提供了包含编码GJB2的核酸序列的分离的多核苷酸。根据一些实施方案，核酸序列是非天然存在的序列。根据一些实施方案，核酸序列编码哺乳动物GJB2。根据一些实施方案，核酸序列编码人类GJB2、小鼠GJB2或大鼠GJB2。根据一些实施方案，核酸序列包含SEQ ID NO:10。根据一些实施方案，核酸序列是针对哺乳动物表达而经过密码子优化的。根据一些实施方案，核酸序列包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13。
[0017]根据一些实施方案，核酸序列包含与SEQ ID NO:11至少85％相同的序列、与SEQ ID NO:12至少85％相同的序列、与SEQ ID NO:13至少85％相同的序列或与SEQ ID NO:18至少85％相同的序列。根据一些实施方案，核酸序列是针对在人类细胞、大鼠细胞或小鼠细胞中表达而经过密码子优化的。根据一些实施方案，核酸序列是cDNA序列。根据一些实施方案，核酸序列还包含可操作地连接的血凝素(HA)C末端标签。根据一些实施方案，核酸序列
可操作地连接到启动子。根本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码GJB2的核酸序列。2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述核酸序列是非天然存在的序列。3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其中所述核酸序列编码哺乳动物GJB2。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸序列编码人类GJB2、小鼠GJB2或大鼠GJB2。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:10。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸序列是针对哺乳动物表达而经过密码子优化的。7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中所述核酸序列包含与SEQ ID NO:11至少85％相同的序列、与SEQ ID NO:12至少85％相同的序列、与SEQ ID NO:13至少85％相同的序列或与SEQ ID NO:18至少85％相同的序列。8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其中所述核酸序列是针对在人类细胞、大鼠细胞或小鼠细胞中表达而经过密码子优化的。9.根据权利要求1
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8中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸序列是cDNA序列。10.根据权利要求1
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9中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸序列还包含可操作地连接的血凝素C末端标签。11.根据权利要求1
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10中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸序列可操作地连接到启动子。12.根据权利要求11所述的多核苷酸，其中所述启动子是遍在活化性CBA、小CBA(smCBA)、EF1a、CASI启动子、耳蜗支持细胞启动子、GJB2表达特异性GFAP启动子、小GJB2启动子、中GJB2启动子、大GJB2启动子或2
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3个单独的GJB2表达特异性启动子的顺序组合。13.根据权利要求11或12所述的多核苷酸，其中所述启动子是经过优化的以驱动GJB2高表达。14.根据权利要求1
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13中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸序列还包含可操作地连接的包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)的3
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UTR调控区。15.根据权利要求1
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14中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸序列还包含可操作地连接的多腺苷酸化信号(pA)。16.根据权利要求15所述的多核苷酸，其中所述多腺苷酸化信号是人类生长激素(hGH)多腺苷酸化信号。17.根据权利要求1
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16中任一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸还包含27个核苷酸的血凝素C末端标签；可操作地连接到经过优化以驱动GJB2高表达的以下启动子元件中的一个：(a)遍在活化性CBA、小CBA(smCBA)、EF1a或CASI启动子；(b)耳蜗支持细胞或GJB2表达特异性的1.68kb GFAP、小/中/大GJB2启动子，或2
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3个单独的GJB2表达特异性启动子的顺序组合；可操作地连接到包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)的3
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UTR调控区，随后是SV40或人类生长激素(hGH)多腺苷酸化信号。18.一种多核苷酸，所述多核苷酸按以下顺序包含CBA
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GJB2(X)
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HA
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WPRE
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pA，其中X包含与SEQ ID NO:18至少85％相同的核酸序列。19.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求1
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18中任一项所述的多核苷酸。20.根据权利要求19所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
21.根据权利要求19或20所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是HEK
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293(293)、Vero、RD、BHK
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21、HT
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1080、A549、Cos
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7、ARPE
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19和MRC
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5。22.根据权利要求21所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是BHK细胞。23.一种重组单纯疱疹病毒(rHSV)，所述重组单纯疱疹病毒(rHSV)包含根据权利要求1
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18中任一项所述的多核苷酸。24.一种转基因表达盒，所述转基因表达盒包含：(a)根据权利要求1
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18中任一项所述的多核苷酸；和(c)最小调控元件。25.一种核酸载体，所述核酸载体包含根据权利要求24所述的表达盒。26.根据权利要求25所述的载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。27.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求24所述的转基因表达盒。28.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求24
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27中任一项所述的表达载体和使用说明书。29.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求1
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18中任一项所述的多核苷酸。30.根据权利要求29所述的载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。31.根据权利要求30所述的载体，其中所述AAV载体的衣壳序列的血清型和ITR的血清型独立地选自由以下组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。32.一种重组腺相关(rAAV)表达载体，所述重组腺相关(rAAV)表达载体包含根据权利要求1
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18中任一项所述的多核苷酸和AAV基因组盒。33.根据权利要求32所述的表达载体，其中所述AAV基因组盒的侧翼是两个序列调节的末端反向重复序列，优选地长度约143个碱基。34.根据权利要求32所述的表达载体，其中所述AAV基因组盒的侧翼是由两个反向相同重复序列组成的自我互补AAV(scAAV)基因组盒，所述两个反向相同重复序列优选地不长于2.4kb，由约113个碱基的使scAAV可行的ITR(ITRΔtrs)隔开，并且在任一末端上侧翼是约143个碱基的序列调节的ITR。35.根据权利要求33或34所述的表达载体，所述表达载体还包含最佳地适于耳蜗递送的蛋白衣壳变体。36.一种重组腺相关(rAAV)表达载体，所述重组腺相关(rAAV)表达载体包含根据权利要求1
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9中任一项所述的多核苷酸，任选地包含具有或不具有血凝素C末端标签的密码子/序列优化的人类GJB2 cDNA，所述血凝素C末端标签优选地长度约27个核苷酸，所述密码子/序列优化的人类GJB2 cDNA任选地尺寸约0.68千碱基(kb)；可操作地连接到经过优化以驱动GJB2高表达的以下启动子元件中的一个：(a)遍在活化性CBA，优选地尺寸约1.7kb；小CBA(smCBA)，优选地尺寸约0.96kb；EF1a，优选地尺寸约0.81kb；或CASI启动子，优选地尺寸约1.06kb；(b)耳蜗支持细胞或GJB2表达特异性GFAP启动子，优选地尺寸约1.68kb；小GJB2启动子，优选地尺寸约0.13kb；中GJB2启动子，优选地尺寸约0.54kb；大GJB2启动子，优选地尺寸约1.0kb，或2
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3个单独的GJB2表达特异性启动子的顺序组合；可操作地连接到包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)的0.9kb 3
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UTR调控区，随后是SV40或人类生长激素(hGH)多腺苷酸化信号，
还包含AAV基因组盒侧翼的两个约143个碱基的序列调节的末端反向重复序列(ITR)，或由两个反向相同重复序列组成的自我互补AAV(scAAV)基因组盒，所述两个反向相同重复序列优选地不长于2.4kb...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯，
申请(专利权)人：应用遗传科技公司，
类型：发明
国别省市：