具有多个用于基因插入的Dock的细胞系制造技术

本发明专利技术涉及含有多个用于核酸构建体并且特别地表达外源目的基因的核酸构建体插入的dock位点的宿主细胞系。dock位点的宿主细胞系。dock位点的宿主细胞系。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有多个用于基因插入的Dock的细胞系
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年6月2日提交的美国临时申请63/033,516的优先权，其全部内容通过援引并入本文。
[0003]本申请还要求2020年6月2日提交的美国临时申请63/033,514的优先权，其全部内容通过援引并入本文。


[0004]本专利技术涉及含有多个用于核酸构建体并且特别地表达外源目的基因的核酸构建体插入的dock位点的宿主细胞系。

技术介绍

[0005]治疗性蛋白质药物是为最需要新型疗法的患者提供服务的一类重要药物。已开发出近期获得批准的重组蛋白治疗剂来治疗多种临床适应症，包括癌症、自身免疫性/炎症、暴露于传染物和遗传病症。蛋白质工程技术的最新进展使药物开发人员和制造商可以微调和利用目的蛋白的理想功能特性，同时保持(在某些情况下提高)产品安全性或功效或两者。
[0006]治疗性蛋白质的制造和生产是高度复杂的过程。例如，典型的蛋白质药物可能包括超过5000个关键工艺步骤，是制造小分子药物所需步骤数量的许多倍。
[0007]类似地，包括单克隆抗体以及大的蛋白质或融合蛋白在内的蛋白质治疗剂的大小可以比分子量超过100kDa的小分子药物大几个数量级。另外，蛋白质治疗剂表现出必须维持的复杂的二级和三级结构。蛋白质治疗剂不能完全通过化学工艺来合成，并且必须在活细胞或生物体中制造；因此，细胞系、物种来源和培养条件的选择都会影响最终产品的特性。而且，大多数的生物活性蛋白需要翻译后修饰，当使用异源表达系统时，这些修饰可能会受到损害。另外，由于产品是由细胞或生物体合成的，因此涉及复杂的纯化过程。此外，还实施病毒清除过程，诸如通过使用过滤器或树脂去除病毒颗粒，以及通过使用低pH值或清洁剂的灭活步骤，以防止蛋白质药物物质病毒污染的严重安全性问题。考虑到治疗性蛋白质在其大分子尺寸、翻译后修饰以及制造过程中涉及的多种生物材料方面的复杂性，增强特定功能属性同时保持通过蛋白质工程策略实现的产品安全性和功效的能力是非常合乎需要的。
[0008]尽管整合新颖策略和方法来修饰蛋白质药物产品并非易事，但是潜在的治疗优势已推动在药物开发过程中增加这类策略的使用。当前正在使用多种蛋白质工程平台技术来增加新的治疗性蛋白质药物的循环半衰期、靶向性和功能性，以及提高产量和产品纯度。例如，蛋白质缀合和衍生化方法，包括Fc融合、白蛋白融合和PEG化，目前正用于延长药物的循环半衰期。
[0009]蛋白质药物(生物制剂)的生产昂贵且耗时。在本领域中需要更有效的工具和方法来生产这类重要药物。

技术实现思路

[0010]本专利技术涉及含有多个用于核酸构建体并且特别地表达外源目的基因的核酸构建体插入的dock位点的宿主细胞系。
[0011]在一些优选的实施方式中，本专利技术提供了包括基因组的宿主细胞(或宿主细胞群)，该基因组包括1至1000个整合的对接位点，每个对接位点包括至少一个dock位点插入元件。在一些优选的实施方式中，基因组包括1至500个整合的对接位点，每个对接位点包括至少一个dock位点插入元件。在一些优选的实施方式中，基因组包括5至500个整合的对接位点，每个对接位点包括至少一个dock位点插入元件。在一些优选的实施方式中，基因组包括5至250个整合的对接位点，每个对接位点包括至少一个dock位点插入元件。在一些优选的实施方式中，基因组包括5至100个整合的对接位点，每个对接位点包括至少一个dock位点插入元件。在一些优选的实施方式中，基因组包括5至50个整合的对接位点，每个对接位点包括至少一个dock位点插入元件。在一些优选的实施方式中，整合的对接位点独立地定位在整个基因组中。
[0012]在一些优选的实施方式中，dock位点插入元件被选自由整合酶、重组酶、核酸酶和切口酶组成的组的酶靶向。在一些优选的实施方式中，dock位点插入元件选自由重组酶dock位点插入元件和HDR dock位点插入元件组成的组。在一些优选的实施方式中，dock位点插入元件是重组酶dock位点插入元件。在一些优选的实施方式中，重组酶dock位点插入元件包括附着位点(att)。在一些优选的实施方式中，附着位点(att)选自由attB和attP组成的组。在一些优选的实施方式中，附着位点(att)选自由attR和attL组成的组。在一些优选的实施方式中，重组酶dock位点插入元件包括LoxP序列。在一些优选的实施方式中，重组酶dock位点插入元件是Flp重组靶点(FRT)位点。在一些优选的实施方式中，dock位点插入元件是HDR dock位点插入元件。在一些优选的实施方式中，HDR dock位点插入元件包括一个或两个dock位点同源臂。在一些优选的实施方式中，HDR dock位点插入元件还包括一个或多个与指导RNA序列同源的序列。在一些优选的实施方式中，dock位点同源臂的长度为约30至1000个碱基。在一些优选的实施方式中，整合酶dock位点插入元件包括AAVS1安全港基因座(safe harbor locus)序列。
[0013]在一些优选的实施方式中，每个对接位点侧翼为外源整合载体序列。在一些优选的实施方式中，外源整合载体序列选自由病毒载体序列和转座子载体序列组成的组。在一些优选的实施方式中，每个对接位点还包括可操作地连接至启动子的编码选择标记的序列。
[0014]在一些优选的实施方式中，宿主细胞系进一步包括可操作地连接至启动子的编码酶的外源序列。在一些优选的实施方式中，可操作地连接至启动子的编码酶的外源序列被插入到宿主细胞的基因组中。在一些优选的实施方式中，在dock位点处插入可操作地连接至启动子的编码酶的外源序列。在一些优选的实施方式中，在游离型表达载体中提供可操作地连接至启动子的编码酶的外源序列。在一些优选的实施方式中，游离型表达载体是质粒。在一些优选的实施方式中，所述酶选自由整合酶、重组酶、核酸酶和切口酶组成的组。在一些优选的实施方式中，核酸酶是Cas核酸酶。在一些优选的实施方式中，切口酶是Cas切口酶。
[0015]在一些优选的实施方式中，将dock位点插入元件定位成促进盒式交换。在一些优
选的实施方式中，每个对接位点包括两个dock位点插入元件。在一些优选的实施方式中，将两个dock位点插入元件定位成促进盒式交换。在一些优选的实施方式中，两个dock位点插入元件位于编码选择标记、酶或其组合的序列的侧翼。
[0016]在一些优选的实施方式中，宿主细胞进一步包括在1个或多个对接位点处插入的核酸表达构建体。在一些优选的实施方式中，核酸表达构建体包括可操作地连接至编码目的蛋白的序列的第二(即内部)启动子。在一些优选的实施方式中，核酸表达构建体进一步包括可操作地连接的5'启动子(或第一启动子)和5'至选择标记。
[0017]在一些优选的实施方式中，核酸表达构建体还包括以下的以5'至3'顺序可操作的联接的元件：第一(或5')启动子序列；选择标记序列；第二(或内部)启动子序列；可操作地连接至内部启动子的编码本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包括基因组的宿主细胞，所述基因组包括1至500个整合的对接位点，每个对接位点包括至少一个dock位点插入元件。2.根据权利要求1所述宿主细胞，其中，所述基因组包括5至500个整合的对接位点，每个对接位点包括至少一个dock位点插入元件。3.根据权利要求1所述宿主细胞，其中，所述基因组包括5至250个整合的对接位点，每个对接位点包括至少一个dock位点插入元件。4.根据权利要求1所述宿主细胞，其中，所述基因组包括5至100个整合的对接位点，每个对接位点包括至少一个dock位点插入元件。5.根据权利要求1所述宿主细胞，其中，所述基因组包括5至50个整合的对接位点，每个对接位点包括至少一个dock位点插入元件。6.根据权利要求1至5中任一项所述的宿主细胞，其中所述整合的对接位点在整个所述基因组中独立地定位。7.根据权利要求1至6中任一项所述的宿主细胞，其中，所述dock位点插入元件被选自由整合酶、重组酶、核酸酶和切口酶组成的组的酶靶向。8.根据权利要求1至7中任一项所述的宿主细胞，其中，所述dock位点插入元件选自由重组酶dock位点插入元件和HDR dock位点插入元件组成的组。9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中，所述dock位点插入元件是重组酶dock位点插入元件。10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其中，所述重组酶dock位点插入元件包括附着位点(att)。11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其中，所述附着位点(att)选自由attB和attP和attR和attL组成的组。12.根据权利要求9所述的宿主细胞，其中，所述重组酶dock位点插入元件包括LoxP序列。13.根据权利要求9所述的宿主细胞系，其中，所述重组酶dock位点插入元件是Flp重组靶(FRT)位点。14.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中，所述dock位点插入元件是HDR dock位点插入元件。15.根据权利要求14所述的宿主细胞系，其中，所述HDR dock位点插入元件包括一个或两个dock位点同源臂。16.根据权利要求15所述宿主细胞系，其中，所述HDR dock位点插入元件进一步包括一个或多个与指导RNA序列同源的序列。17.根据权利要求15至16中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述dock位点同源臂的长度为约30至1000个碱基。18.根据权利要求14所述的宿主细胞，其中，所述整合酶dock位点插入元件包括AAVS1安全港基因座序列。19.根据权利要求1至18中任一项所述的宿主细胞系，其中，每个对接位点侧翼为外源整合载体序列。20.根据权利要求18所述的宿主细胞系，其中，所述外源整合载体序列选自由病毒载体
序列和转座子载体序列组成的组。21.根据权利要求1至20中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述对接位点每个进一步包括可操作地连接至启动子的编码选择标记的序列。22.根据权利要求1至21中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述宿主细胞系进一步包括可操作地连接至启动子的编码酶的外源序列。23.根据权利要求1至22中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述可操作地连接至启动子的编码酶的外源序列被插入到所述宿主细胞的基因组中。24.根据权利要求23所述的宿主细胞系，其中，所述可操作地连接至启动子的编码酶的外源序列在所述dock位点处插入。25.根据权利要求1至22中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述可操作地连接至启动子的编码酶的外源序列在游离型表达载体中提供。26.根据权利要求25所述的宿主细胞系，其中，所述游离型表达载体是质粒。27.根据权利要求22至26中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述外源酶选自由整合酶、重组酶、核酸酶和切口酶组成的组。28.根据权利要求27所述的宿主细胞系，其中，所述核酸酶是Cas核酸酶。29.根据权利要求27所述的宿主细胞，其中，所述切口酶是Cas切口酶。30.根据权利要求1至29中任一项所述的宿主细胞系，其中，将所述dock位点插入元件定位成促进盒式交换。31.根据权利要求1至30中任一项所述的宿主细胞系，其中，每个对接位点包括两个dock位点插入元件。32.根据权利要求31所述的宿主细胞系，其中，将所述两个dock位点插入元件定位成促进盒式交换。33.根据权利要求31至32中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述两个dock位点插入元件位于编码选择标记、酶或其组合的序列的侧翼。34.根据权利要求1至33中任一项所述的宿主细胞系，进一步包括在1个或多个所述对接位点处插入的核酸表达构建体。35.根据权利要求34所述的宿主细胞系，其中，所述核酸表达构建体进一步包括可操作地连接至选择标记第一启动子。36.根据权利要求34所述的宿主细胞系，其中，所述核酸表达构建体包括可操作地连接至编码目的蛋白的序列的第二启动子。37.根据权利要求34至36中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述核酸表达构建体进一步包括以下以5'至3'的顺序可操作的联接的元件：第一启动子序列；选择标记序列；第二启动子序列；可操作地连接至所述内部启动子的编码第一目的蛋白的核酸序列；和多聚A信号序列。38.根据权利要求34至37中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述核酸构建体进一步包括至少一个插入元件，所述插入元件在选自由以下组成的组的一个或多个位置处：5'至所
述第一启动子、3'至所述多聚A信号序列、在所述第一启动子和所述多聚A信号序列之间、在所述选择标记和所述第二启动子序列之间，以及5'至所述第一启动子和3'至所述多聚A信号序列两者。39.根据权利要求34至38中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述核酸表达构建体不包括在所述选择标记和所述第二启动子之间的多聚A信号序列。40.根据权利要求34至39中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述选择标记邻近所述第二启动子。41.根据权利要求34至40中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述第二启动子邻近所述编码第一目的蛋白的核酸序列。42.根据权利要求34至41中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述核酸构建体包括在所述第一启动子和所述选择标记之间的延伸包装区(EPR)。43.根据权利要求42所述的宿主细胞系，其中，所述EPR包括多个潜在的Kozak序列和/或ATG翻译起始位点。44.根据权利要求34至43中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述第一启动子序列选自由以下组成的组：SIN
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LTR、SV40、EF1α、大肠杆菌lac、大肠杆菌trp、噬菌体λPL、噬菌体λPR、T3、T7、巨细胞病毒(CMV)即刻早期、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、α
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乳清蛋白和小鼠金属硫蛋白
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I启动子序列。45.根据权利要求34至44中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述第一启动子序列是弱启动子序列。46.根据权利要求34至45中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述第一启动子序列不是逆转录病毒LTR启动子。47.根据权利要求1至34中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述对接位点进一步包括外源启动子。48.根据权利要求47所述的宿主细胞系，其中，所述外源启动子序列选自由以下组成的组：SIN
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LTR、SV40、EF1α、大肠杆菌lac、大肠杆菌trp、噬菌体λPL、噬菌体λPR、T3、T7、巨细胞病毒(CMV)即刻早期、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、α
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乳清蛋白和小鼠金属硫蛋白
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I启动子序列。49.根据权利要求48所述的宿主细胞系，其中，所述启动子是逆转录病毒LTR。50.根据权利要求49所述的宿主细胞系，其中，所述逆转录病毒LTR是SIN LTR。51.根据权利要求50所述的宿主细胞系，其中，每个对接位点包括所述对接位点的SIN LTR EPR 5'和所述对接位点的SIN LTR 3'。52.根据权利要求47至51中任一项所述的宿主细胞系，进一步包括在1个或多个所述对接位点处插入的核酸表达构建体。53.根据权利要求52所述的宿主细胞系，其中，所述核酸表达构建体包括可操作地连接至编码目的蛋白的序列的第二启动子。54.根据权利要求1至34和47至52中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述核酸表达构建体进一步包括以下以5'至3'的顺序可操作的联接的元件：选择标记序列；内部启动子序列；
可操作地连接至所述内部启动子的编码第一目的蛋白的核酸序列；和多聚A信号序列。55.根据权利要求52至54中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述核酸构建体进一步包括至少一个插入元件，所述插入元件在选自由以下组成的组的一个或多个位置处：5'至所述选择标记序列、3'至所述多聚A信号序列、在所述选择标记序列和所述多聚A信号序列之间、在所述选择标记和所述内部启动子序列之间，以及5'至所述选择标记和3'至所述多聚A信号序列两者。56.根据权利要求52至55中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述核酸表达构建体不包括在所述选择标记和所述第二启动子之间的多聚A信号序列。57.根据权利要求54至56中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述选择标记邻近所述内部启动子序列。58.根据权利要求54至56中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述内部启动子序列邻近所述编码第一目的蛋白的核酸序列。59.根据权利要求54至58中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述内部启动子序列选自由以下组成的组：SV40、EF1α、大肠杆菌lac、大肠杆菌trp、噬菌体λPL、噬菌体λPR、T3、T7、巨细胞病毒(CMV)即刻早期、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、α
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乳清蛋白和小鼠金属硫蛋白
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I启动子序列。60.根据权利要求34至59中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述选择标记序列是选自由谷氨酰胺合成酶(GS)序列和二氢叶酸还原酶(DHFR)序列组成的组的可扩增的选择标记序列。61.根据权利要求34至59中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述选择标记序列是选自由新霉素抗性基因(neo)、潮霉素B磷酸转移酶基因和嘌呤霉素N
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乙酰转移酶基因序列组成的组的抗生素抗性标记序列。62.根据权利要求34至61中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述第二启动子序列选自由以下组成的组：SV40、EF1α、大肠杆菌lac、大肠杆菌trp、噬菌体λPL、噬菌体λPR、T3、T7、巨细胞病毒(CMV)即刻早期、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、α
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乳清蛋白和小鼠金属硫蛋白
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I启动子序列。63.根据权利要求34至62中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述编码目的蛋白的核酸序列编码选自由重链和轻链免疫球蛋白序列组成的组的蛋白质。64.根据权利要求34至63中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述插入元件选自由重组酶插入元件和HDR插入元件组成的组。65.根据权利要求64所述的宿主细胞系，其中，所述表达构建体插入元件是与重组酶dock位点插入元件相容的重组酶表达构建体插入元件。66.根据权利要求65所述的宿主细胞系，其中，所述重组酶表达构建体插入元件是附着位点(att)。67.根据权利要求66所述的宿主细胞系，其中，所述附着位点(att)选自由attP和attB组成的组。68.根据权利要求64所述的宿主细胞系，其中，所述重组酶表达构建体插入元件是Flp重组靶(FRT)位点。
69.根据权利要求64所述的宿主细胞系，其中，所述重组酶表达构建体插入元件是LoxP序列。70.根据权利要求64所述的宿主细胞系，其中，所述表达构建体插入元件是与HDR dock位点插入元件相容的HDR表达构建体插入元件。71.根据权利要求70所述的宿主细胞系，其中，所述HDR表达构建体插入元件包括与一个或两个dock位点同源臂相容或同源的一个或两个表达构建体同源臂。72.根据权利要求71所述的宿主细胞系，其中，所述同源臂的长度为约30至1000个碱基。73.根据权利要求72所述的宿主细胞系，其中，所述重组酶表达构建体包括定位在5'至所述第一启动子和3'至所述多聚A信号序列的两个同源臂。74.根据权利要求70所述的宿主细胞系，其中，所述HDR表达构建体插入元件包括AAVS1安全港基因座序列。75.根据权利要求34至74中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述核酸表达构建体进一步包括第一RNA输出元件。76.根据权利要求75所述的宿主细胞系，其中，所述第一RNA输出元件位于3'或5'至所述编码目的蛋白的核酸序列。77.根据权利要求76所述的宿主细胞系，其中，所述第一RNA输出元件是前mRNA加工增强子(PPE)。78.根据权利要求76所述的宿主细胞系，其中，所述第一RNA输出元件是转录后调节元件(PRE)。79.根据权利要求78所述的宿主细胞系，其中，所述PRE RNA输出元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。80.根据权利要求34至79中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述核酸表达构建体进一步包括编码第二目的蛋白的核酸序列。81.根据权利要求80所述的宿主细胞系，其中，所述编码第二目的蛋白的核酸序列与选自由第三启动子、内含子、第二RNA输出元件和IRES序列及其组合组成的组的构建体元件可操作地联接。82.根据权利要求81所述的宿主细胞系，其中，所述第二RNA输出元件是前mRNA加工增强子(PPE)。83.根据权利要求82所述的宿主细胞系，其中，所述第二RNA输出元件是转录后调节元件(PRE)。84.根据权利要求83所述的宿主细胞系，其中，所述PRE RNA输出元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。85.根据权利要求80至84中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述编码第二目的蛋白的第二核酸序列定位在3'至所述编码第一目的蛋白的核酸序列。86.根据权利要求85所述的宿主细胞系，其中，所述编码第二目的蛋白的第二核酸序列与选自由口蹄疫病毒(FDV)、脑心肌炎病毒和脊髓灰质炎病毒IRES序列组成的组的IRES序列可操作地联接。87.根据权利要求34至86中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述核酸表达构建体进一
步包括可操作地连接至所述第一目的蛋白的信号肽序列。88.根据权利要求87所述的宿主细胞，其中，所述信号肽序列选自由以下组成的组：组织纤溶酶原激活物、人生长激素、乳铁蛋白、α
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酪蛋白和α
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乳清蛋白信号肽序列。89.根据权利要求34至88中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述核酸表达构建体进一步包括蛋白质纯化标记序列。90.根据权利要求89所述的宿主细胞系，其中，所述蛋白质纯化标记序列是六组氨酸标签或血凝素(HA)标签。91.根据权利要求1至34和47至52中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述核酸构建体编码病毒载体。92.根据权利要求91所述的宿主细胞系，其中，所述病毒载体选自由逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺病毒相关病毒载体组成的组。93.根据权利要求92所述的宿主细胞系，...

【专利技术属性】
技术研发人员：格雷戈里，
申请(专利权)人：康泰伦特药物解决方案有限责任公司，
类型：发明
国别省市：