一种基因敲除型杆状病毒表达载体制造技术

本发明专利技术公开了一种基因敲除型杆状病毒表达载体，涉及生物技术领域。本发明专利技术将杆状病毒表达载体上五个连续的非必需基因Ac29、Ac30、Ac31、Ac32和Ac33同时敲除后即获得所述基因敲除型杆状病毒表达载体。本发明专利技术的基因敲除型杆状病毒表达载体使外源蛋白表达水平提高80%。同时病毒的增殖特性不受影响。表达产量的提高能显著降低企业的生产成本。该杆状病毒表达载体可用于生物制品工业领域，特别是亚单位疫苗工业领域。工业领域。工业领域。

【技术实现步骤摘要】
一种基因敲除型杆状病毒表达载体


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种基因敲除型杆状病毒表达载体。

技术介绍

[0002]杆状病毒是特异感染节肢动物的双链DNA病毒，苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒（Autographa californica nucleopolyhedrovirus, AcMNPV）是杆状病毒的模式种。自从1983年Smith GE等首次用杆状病毒在昆虫细胞中表达人β
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干扰素基因以来（Mol Cell Biol. 1983; 3:2156
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65.），由于具有低成本、高产量，而且具备各种翻译后修饰系统等优点，杆状病毒表达载体系统在科研和生产中被广泛应用。
[0003]然而，相较于工业上普遍使用的原核表达系统（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌）和酵母表达系统，杆状病毒表达载体系统的产量还不尽人意，这导致杆状病毒表达系统的生产成本居高不下。
[0004]因此，需要研究特定的技术手段以提高上述表达载体系统的产量。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种基因敲除型高产重组杆状病毒载体，旨在解决
技术介绍
提及的表达量低的问题。
[0006]为达到上述目的，本专利技术主要提供了如下技术方案：一方面，本专利技术实施例提供了一种基因敲除型杆状病毒表达载体，将杆状病毒AcMNPV表达载体上五个连续的非必需基因Ac29、Ac30、Ac31、Ac32和Ac33同时敲除后即获得所述基因敲除型杆状病毒表达载体。
[0007]作为优选，所述Ac29的敲除是指所述Ac29的启动子区被破坏或所述Ac29的编码区被破坏或所述Ac29的启动子区与其编码区被同时破坏。
[0008]作为优选，所述Ac30的敲除是指所述Ac30的启动子区被破坏或所述Ac30的编码区被破坏或所述Ac30的启动子区与其编码区被同时破坏。
[0009]作为优选，所述Ac31的敲除是指所述Ac31的启动子区被破坏或所述Ac31的编码区被破坏或所述Ac31的启动子区与其编码区被同时破坏。
[0010]作为优选，所述Ac32的敲除是指所述Ac32的启动子区被破坏或所述Ac32的编码区被破坏或所述Ac32的启动子区与其编码区被同时破坏。
[0011]作为优选，所述Ac33的敲除是指所述Ac33的启动子区被破坏或所述Ac33的编码区被破坏或所述Ac33的启动子区与其编码区被同时破坏。
[0012]另一方面，本专利技术提供了一种重组蛋白，用所述新型杆状病毒表达载体构建重组病毒，然后感染昆虫宿主细胞，所述宿主细胞经过培养、增殖并表达为重组蛋白，即获得所述重组蛋白。
[0013]又一方面，本专利技术提供了所述新型杆状病毒表达载体在疫苗工业上的应用。
[0014]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
本专利技术在研究时发现杆状病毒基因组中存在大量非必需基因，并且一些非必需基因彼此相邻成簇存在，这些成簇存在的非必需基因（含未知功能基因）包括Ac29到Ac33连续的五个基因；本专利技术在同时敲除连续的五个病毒非必需基因Ac29、Ac30、Ac31、Ac32和Ac33后，发现蛋白表达水平显著提高、病毒的增殖水平没有明显变化，其说明本专利技术通过上述敲除技术可以提供一个具有优良生产性状和高产特性的杆状病毒表达载体。
[0015]附图说明
[0016]图1 本专利技术提供的杆状病毒载体的基因敲除策略示意图；图2 使用本专利技术提供的杆状病毒载体表达的荧光素酶FluC全细胞蛋白电泳图；图3 使用本专利技术提供的杆状病毒载体表达的绿色荧光蛋白GFP总荧光强度柱状图；图4 本专利技术提供的杆状病毒载体的一次生长曲线。
具体实施方式
[0017]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0018]下面结合附图对本专利技术的应用原理作详细的描述。
[0019]实施例1。
[0020]1、Ac29
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33基因的敲除。
[0021]用带有Ac29
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33上下游50bp同源臂的引物（SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2），以pTriEx1.1质粒为模板，扩增氨苄青霉素抗性基因片段，获得了1023bp的PCR产物（SEQ ID NO:3）。
[0022]将获得的PCR产物用电转化的方法转入带有RedET质粒和Bacmid的大肠杆菌菌株HS996中，经阿拉伯糖诱导产生重组酶，重组后的大肠杆菌经氨苄青霉素抗性平板筛选，菌落PCR验证，获得阳性克隆。此时Ac29
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33 DNA片段已经被氨苄青霉素抗性基因片段替换。从大肠杆菌HS996中提取Bacmid，测序鉴定后命名为BacmidΔAc29
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33（敲除策略见附图1）。
[0023]BacmidΔAc29
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33经Bsu36I限制性内切酶酶切线性化之后，供后续实验使用。
[0024]2、表达萤光素酶Fluc。
[0025]线性化的BacmidΔAc29
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33与pTriEx
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FluC质粒（FluC基因片段克隆在pTriEx1.1 NcoI/XhoI位点之间）共转染Sf9昆虫细胞，转染后5天收集P0代重组病毒。P0代病毒扩增至P1代病毒，以3 MOI感染High Five细胞，感染后第四天收集细胞。细胞裂解后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、考马斯亮蓝染色检测（附图2）。考染的凝胶通过密度扫描数值化，计算结果比较后发现，萤光素酶Fluc产量相对于野生型提高了80%。
[0026]3、表达绿色荧光蛋白GFP。
[0027]线性化的BacmidΔAc29
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33与pTriEx
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GFP质粒（GFP基因片段克隆在pTriEx1.1 NcoI/XhoI位点之间）共转染Sf9昆虫细胞，转染后5天收集P0代重组病毒。P0代病毒扩增至P1代病毒，以3 MOI感染Sf9细胞，感染后第四天收集细胞。用流式细胞仪检测细胞的绿色荧
光强度，并计算几何平均数（附图3）。比较后发现绿色荧光蛋白GFP产量相对于野生型提高了86%。
[0028]4、病毒增殖特性。
[0029]利用带有绿色荧光蛋白的重组病毒以0.1 MOI感染Sf9细胞，之后每24小时取一次样，用极限稀释法测定病毒滴度，绘制病毒一次生长曲线（附图4）。与野生型病毒相比，Ac29
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33敲除病毒增殖特性未见显著变化。
[0030]本专利技术的创新思路：本专利技术在研究时发现杆状病毒基因组中存在大量非必需基因，并且一些非必需基因彼此相邻成簇存在，这些成簇存在的非必需基因（含未知功能基因）包括Ac29到Ac33连续的五个基因。
[0031]Ac29基因功能未知。在家蚕多角体病毒中敲除同源基因Bm20不影响病毒的复本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因敲除型杆状病毒表达载体，其特征在于，将杆状病毒AcMNPV表达载体上五个连续的非必需基因Ac29、Ac30、Ac31、Ac32和Ac33同时敲除后即获得所述基因敲除型杆状病毒表达载体。2.如权利要求1所述的一种基因敲除型杆状病毒表达载体，其特征在于，所述Ac29的敲除是指所述Ac29的启动子区被破坏或所述Ac29的编码区被破坏或所述Ac29的启动子区与其编码区被同时破坏。3.如权利要求1所述的一种基因敲除型杆状病毒表达载体，其特征在于，所述Ac30的敲除是指所述Ac30的启动子区被破坏或所述Ac30的编码区被破坏或所述Ac30的启动子区与其编码区被同时破坏。4.如权利要求1所述的一种基因敲除型杆状病毒表达载体，其特征在于，所述Ac31的敲除是指所述Ac31的启动子区被破坏或所述Ac31的编码区被破坏或所述Ac31的启...

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ五一IntClC一二N一五八六六，
申请(专利权)人：陕西杆粒生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：